ШТАММ МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ГРИБА ASPERGILLUS NIGER-ПРОДУЦЕНТ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 1997 года по МПК C12P7/48 C12N1/14 C12N1/14 C12R1/685 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения штамма-продуцента лимонной кислоты для ферментации сахаросодержащих сред поверхностным способом культивирования.

Известен штамм Aspergillus niger R-3 (ЦМПМ F-132), полученный на экспериментальном заводе биохимических препаратов AH Латвийской ССР в результате селекции путем ступенчатой обработки этиленимином, N-нитрозометилмочевиной и УФ-лучами [1] Выход лимонной кислоты от сахара мелассы составляет 99% при этом не приводят сведений о качестве мелассы, начальной массовой концентрации сахара в мелассной среде, высоте слоя среды и длительности ферментации, что не позволяет оценить биосинтетическую активность штамма. Однако практика использования этого штамма в промышленности позволяет сделать вывод, что по активности он сравним со штаммом Asp.niger Л-130(ЦHПМ F-204), являющимся наиболее близким по технической сущности к достигаемому положительному эффекту предлагаемому штамму. Штамм Asp.niger Л-130 взятый в качестве прототипа, селекционирован в результате многоступенчатой селекции с использованием искусственного отбора естественно возникающих активных вариантов и мутагенных факторов физической и химической природы [2] Продуктивность штамма F-204 по лимонной кислоте при ферментации мелассных сред поверхностным способом в течение 7 сут при высоте слоя 12 см достигала 2100 г в пересчете на 1 м² в сут, выход кислоты от сахара составлял 82% К недостаткам штамма следует отнести приобретение им в процессе промышленного использования отрицательного свойства миколизиса в период роста и деления клеток, выражающегося в образовании некротических участков в начальный период синтеза мицелиальной пленки на поверхности ферментируемого раствора. Миколизис индуцируется физиологическими условиями: высокой концентрацией компонентов меласс индукторов миколизиса, высокой концентрацией синтезируемого продукта, высоким осмотическим давлением среды и др. [3] Недостатком штамма является также применение в качестве наполнителя к конидиям в посевном материале талька, угнетающего кислотообразование, вероятно, за счет наличия в нем примесей (железо, хром, алюминий и др.)[4]
Цель изобретения получение штамма-продуцента лимонной кислоты с высокой стабильной продуктивностью при ферментации мелассных сред методом поверхностного культивирования и устойчивого к неблагоприятным факторам среды в условиях современного производства.

Предлагаемый штамм Asp.niger получен из промышленного штамма Л-130 (ЦHПМ F-204) с использованием генетико-селекционных приемов конструирования штаммов на основе мутагенеза с помощью УФ-лучей и отбора.

Селекционный штамм Asp.niger депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером F-714.

Штамм Asp.niger F-714 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Новый штамм Asp.niger F-714 на сусло-агаре через 5 сут культивирования образует колонии диаметром 4,2-0,5 см. Окраска конидиальных головок бежевого цвета, в центре колонии диаметром до 2 см более темного, к краю более светлого цвета. Обрамляющая колонию зона незрелых конидий почти белая. По самому краю колонии, шириной 1-2 мм аспорогенная нарастающая зона с практически неопушенным мицелием. Обратная сторона колонии гладкая. Конидиальные головки шаровидные диаметром 123-6 мкм. Вздутия конидиеносцев шаровидные размером (30-1)•(29-1) мкм. Стеригмы двуслойные. Размер стеригм первого порядка (7-1)•(3,5-0,0) мкм, второго (6,4-0,7)•(4,1-0,7) мкм. Диаметр конидий 3,40-0,05 мкм. Оболочка конидий бежевой окраски. Конидиеносцы прямые бесцветные длиной 2400-200 мкм, шириной 15-2 мкм.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб.

Температурный диапазон роста 20 38^oC.

Оптимальная температура роста 32 1^oC
Оптимум pH 6,8 7,2.

Отношение к источникам азота: усваивает азот органических соединений, например, белок, пептон, аминокислоты, дрожжевой автолизат, мочевину, а также ассимилирует азот минеральных солей, предпочтительнее соли аммония, нитраты.

Отношение к источникам углерода: хорошо усваивает и растет на мальтозе, сахарозе, глюкозе, фруктозе, ксилозе, маннозе, в меньшей степени усваивает декстрин, сорбит, крахмал, раффинозу и плохо растет на лактозе.

Хорошо хранится в виде высушенных конидий (до 5 10% остаточной влажности) или в виде культуры, выращенной на сусло-агаре, или в лиофильно-высушенном состоянии.

Температура культивирования 32-1^oC.

Длительность культивирования 7-10 сут.

Температура хранения 18-1^oC.

Генетические особенности (ауксотрофность) прототроф.

Штамм Asp.niger F-714 индентифицирован по определителю грибов рода Aspergillus [5]
Штамм F-714 отличается от штамма F-204 бежевым цветом конидиальных головок. Все предшественники и производственные штаммы для поверхностного способа ферментации имеют кодии черного цвета. У прототипа конидии черной окраски с зеленоватым отливом. Стеригмы 1 порядка у штамма F-714 короче в 3-4 раза, вздутия конидиеносцев более мелкие (в 1,5 раза), чем у прототипа. Предлагаемый штамм F-714 отличается более высокой продуктивностью и способностью к большей конверсии сахаров в лимонную кислоту, а также повышенной устойчивостью к компонентам мелассной среды и продуктам жизнедеятельности, что исключает миколизис в процессе формирования мицелиальной пленки.

Сущность изобретения поясняется следующими конкретными примерами использования штамма F-714.

Пример 1. Посевной материал (конидии) штамма получали при твердофазном культивировании штамма на сусло-агаровой среде с добавлением, г/дм³: хлористого натрия 20; мочевины 1 и сульфата меди 0,0001 или на картофельно-глюкозном агаре при 32^oC в течение 10 сут.

Продуктивность штамма по лимонной кислоте оценивали по показателям, полученным при ферментации мелассных сред методом поверхностного культивирования. Ферментацию проводили в химических стаканах с площадью дна 0,41 дм². Объем ферментируемой мелассной среды 500 см³ (высота слоя среды 12 см). Продолжительность ферментации 7 сут. Температура воздуха в термостатной комнате 32^oC. Для приготовления сред использовали образец мелассы средней ферментируемости. Состав ферментационной среды г/дм³: свекловичная меласса 326; карбонат натрия 0,4; гексацианоферроат калия, тригидрат 1,26; дигидроортофосфат калия 0,1; сульфат цинка, семиводный 0,005; трилон Б 0,2; вода водопроводная до 1 дм³; pH 7,0. Образец мелассы содержал 8,5 г/кг кальция в пересчете на CaO; 460 г/кг ферментируемых сахаров, в т.ч. инвертного сахара 14 г/кг; pH 6,0.

Для засева ферментационной среды использовали посевной материал штаммов F-204 и F-714, представляющий собой или чистые конидии гриба без наполнителя или смесь конидий с наполнителем в массовом соотношении 1:1. В качестве наполнителя применяли японский активный уголь, размер частиц которого соизмерим с размером конидий (около 4 мкм); тальк или солодовые ростки такого же помола. Наполнители предварительно стерилизовались, полностью высушивались и смешивались с конидиями.

Засев питательной среды производили путем напыления на ее поверхность тонкого слоя посевного материала штаммов пульверизатором.

Результаты ферментации, представленные в таблице, показывают, что вновь селекционированный штамм при использовании всех трех наполнителей превосходит прототип как по синтезу лимонной кислоты, так и по способности конвертировать сахара мелассы в лимонную кислоту. Кроме того, штамм F-714 имеет значительно более высокую продуктивность на единицу биомассы при полном отсутствии миколизиса.

Вновь селекционированный штамм продуцирует на 6,8 9,2% больше лимонной кислоты на 1 м² в сут, при этом конверсия сахаров в лимонную кислоту по сравнению с прототипом возрастает на 4,9 8,0%
Пример 2. Условия опыта аналогичны условиям примера 1. Отличие состоит в том, что для приготовления ферментационной среды использовали образец мелассы хорошей ферментируемости, содержащий 8,5 г/кг кальция в пересчете на CaO; 490 г/кг сахаров, в т.ч. 10 г/кг инвертного сахара; pH 6,2. Состав ферментационной среды, г/дм³: свекловичная меласса 306; карбонат натрия 0,3; гексацианоферроат калия, тригидрат 1,1; дигидроортофосфат 0,15; сульфат цинка; семиводный 0,005; вода водопроводная до 1 дм², pH 7,0.

Из представленных в таблице результатов ферментации видно, что предлагаемый штамм при применении этой мелассы еще более выгодно отличается от прототипа. Масса синтезируемой лимонной кислоты с 1 м³ в сут. у штамма F-714 возросла по сравнению с прототипом на 5,3 12,8% а конверсия сахаров в лимонную кислоту соответственно на 4,3 -10,5% в зависимости от наполнителя. Следует отметить, что и в данном примере наиболее высокие результаты ферментации получены у посевного материала, в котором в качестве наполнителя служили солодовые ростки или активный уголь. На этом образце мелассы у штамма прототипа степень миколизиса была слабее, а у предлагаемого штамма, как и в предыдущем примере миколизис отсутствовал.

Приведенные примеры показывают преимущество предлагаемого штамма по сравнению с прототипом. Наряду с приобретенными в результате селекции свойствами повышенной способности к синтезу лимонной кислоты (на 5,3 12,8%) и конверсии сахара (на 4,9 10,5%) следует отметить и устойчивость нового штамма к компонентам мелассной среды, о чем свидетельствует отсутствие некротических участков на формирующейся мицелиальной пленке. Кроме того, одним из преимуществ является снижение синтеза грибом меланина (новый штамм имеет бежевую окраску конидий, в то время как все известные промышленные штаммы для поверхностного способа культивирования образуют черноокрашенные конидии), что упрощает контроль за присутствием посторонней микрофлоры и облегчает обработку технологического оборудования, так как культура предлагаемого штамма не образует трудносмываемый пигментированный налет.

Использование: биотехнология, производство лимонной кислоты. Сущность изобретения: новый штамм Aspergillus niger ВКПМ F-714 получен с использованием генетико-селекционных приемов на основе мутагенеза с помощью УФ-лучей. Продуктивность данного штамма по лимонной кислоте выше, чем у штамма-аналога на 5,3 - 12,8%, способность к конверсии сахаров в лимонную кислоту - соответственно на 4,9 - 10,5%. Штамм устойчив к компонентам мелассной среды. Еще одним преимуществом нового штамма является снижение продуцирования меланинов (штамм имеет бежевую окраску конидий), что упрощает контроль за присутствием микрофлоры и обработку технологического оборудования. 1 табл.

Штамм микроскопического гриба Aspergillus niger ВКПМ F-714 продуцент лимонной кислоты.