Способ определения нарушения целостности мембран эритроцитов при рентгеновском облучении Советский патент 1992 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к биохимии и клинической гематологии и предназначено для определения нарушения целостности мембран эритроцитов.

Известен способ определения нарушений целостности мембран эритроцитов, заключающийся в том, что проба крови с антикоагулянтом гепарином инкубируется в термостате при 37°С 1 ч, затем выделяется фракция эритроцитов в объеме 0,5 мл, в нее добавляется детергент и наносится на поверхность 36%-ного раствора урографина, центрифугируется при 15000 g 20 мин. После этого отбирается верхняя зона, а также отдельно собирается осадок, растворяется в дистиллированной воде и измеряется оптическая плотность каждой фракции при 380 нм. По калибровочной кривой, полученной путем сопоставления количества эритроцитов после подсчета их в камере Горяева и соответствующей оптической плотности этих же проб после гемолиза, определяют количество образующих каждую зону. Способ позволяет определить нарушение целостности мембран эритроцитов только после

обработки клеток 0,3%-ным раствором детергентов (твин-80, тритон х-100 и др.).

Однако известный способ является трудоемким, требует наличие урографина, детергентов и высокоскоростной центрифуги.

Цель изобретения -упрощение способа за счет сокращения числа операций и процедур.

Способ осуществляется следующим образом.

Эритроциты крыс после общего рентгеновского облучения в дозе 7,6 г отмывают, инкубируют в изотонической среде 2 мМ АТФ и 2 мМ Мд2+, 50 мМ трис-HCI при рН 7,5 для определения АТФ и 2 мМ АМФ, 30 мМ Мд2+, 145 мМ трис-HCI при рН 8,6 для определения 5 -нуклеотидазы. Расчет активности ферментов проводят по выходу неорганического фосфата, выделенного 1 млн. клеток за 1 ч инкубации. Количественное определение неорганического фосфата проводят по общепринятому методу с помощью раствора молибдата аммония и хлористого олова. Окраска развивается при комнатной

ё

СА) СЛ VJ VI VJ

температуре через 20 мин и в дальнейшем не изменяется.

Активность ферментов, локализованных на наружной мембране через 3 ч после облучения, резко увеличивается и составляет для 51-нуклеотидазы 186% от исходного уровня, а для АТФазы 196% соответственно. Результаты эксперимента приведены в таблице.

Пример. Выделенные и отмытые после облучения животных эритроциты помещают в субстратную среду, содержащую 2 мМ АТФ и 2 мМ Мд , 50 мМ трис-HCI при рН 7,5 для определения АТФазы и 2 мМ АМФ, 30 мМ Мд2+, 145 мМ трис-HCI при рН 8,6 для определения 5 -нуклеотидазы, инкубируют в термостате при 37°С 1 ч, количество поврежденных эритроцитов через 3 ч 26,59 + 5,75 млн. клеток, а активность 5 - нуклеотидазы, АТФ увеличивается и состав- ляет 186% от исходного уровня, а активность АТФ - 196%.

Для проверки степени корреляции целостности мембраны с активацией гидролиза АМФ и АТФ в первые часы после облучения нами применен L-токоферолаце- тат как средство, стабилизирующее мембраны. Для этого животным за 18 ч до облучения внутрибрюшинно вводят L-токо- феролацетат в дозе 30 мг на 100 г массы. Количество поврежденных эритроцитов через 3 ч после облучения на фоне введения

мало чем отличалось от такового при облучении и только 24 ч после облучения приближалось к уровню исходных величин у интантных животных (116,4% + 5,9%) от

контроля. Активность АТФ и 51-нуклеотида- зы составляет в эти сроки 157 и 91,2%, а через 24 ч 139,7 и 75%. Структурная целостность мембраны, модифицированная токо- фероацетатом, коррелирует с активностью

мембраносвязанных ферментов 51-нуклео- тидазной и АТФ.

Предлагаемый способ позволяет определить повреждение целостности мембран эритроцитов в ранние сроки после облучения в любой клинической лаборатории.

Способ более экономичен, не требует дорогостоящих реактивов и оборудования, а также более корректен, так как используются нативные эритроциты, не обработанные детергентами.

Формула изобретения Способ определения нарушения целостности мембран эритроцитов при рентгеновском облучении путем инкубации

эритроцитов и регистрации показателя проницаемости мембран, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, регистрируют активность 51-нуклеотидазы и АТФ-азы в эритроцитах, при увеличении активности через 3 ч после облучения животного определяют нарушение целостности мембран эритроцитов,

Использование: биохимия, клиническая гематология. Сущность изобретения: эритроциты после рентгеновского облучения от- мывают и инкубируют в изотонической среде, содержащей 2 мМ АТФ и 2 мМ Мд , 50 мМ трис-HCI при рН 7,5 для определения АТФазы и 2 мМ АМФ, 30 мМ Мд2+, 145,0 мМ трис-HCI при рН 8,6 для определения 51- нуклеотидазы. Способ позволяет определить повреждение эритроцитов в первые сутки после облучения. Для исследования используются нативные эритроциты, не обработанные детергентами. Табл.1.