Способ определения фосфогидролаз в тканях Советский патент 1985 года по МПК A61B10/00 G01N33/48 

05 СП

СО

to Изобретение относится к медицине, в частности к гистологии и цитохимии ферментов, и может быть использовано в практической медицине и биологии. Цель изобретения - повышение точности определения. Способ осуществляют следующим образом. Исследуемую ткань фиксируют в течение 1,5- 2 ч в составе: 0,1 М фосфатный буфер с рН 7,4, содержащий .формальдегид 2,0- 4,0 мае. 5Ь. Затем, промывают в растворе сахарозы и изготавливают с этих кусочков в криостате срезы толщиной 40-50 мкм. Полученные срезы инкубируют в течение 25-30 мин при 36-37°С в среде состава, мМ: субстрат 2-2,2, трыс-малеатный буфер с рН 7,2 80-90, соль магния 2-2,2, сахароза 0,25-0,28, соль свинца 2-2,2. По выпадению осадка определяют наличие фосфогидролаз. Пример 1. Проводят ультрацитохимическое определение фосфогидролаз (АТФазы и 5-нуклеотидазы) в клетках печени белых крыс. Кусочки печени крысы толщиной 2-3 мм фиксируют 2 ч в фиксирующей смеси следующего состава: 0,1 М фосфатный буфер (рН 7,4), содержащий 3 мае./и пформальдегида при 4°С, промывают в трех сменах 0.25 М сахарозы при 4°С соответственно 10, 20 в 30 мин и изготавливают с этих кусочков в криостате срезы толщиной 40- 50 мкм. Полученные срезы затем инкубируют 30 мин при 37°С в инкубационной среде состава, мМ: субстрат 2,1; трыс-малеатный буфер с рН 7,2 85; соль магния 2,1; сахароза 0,26; соль свинца 2,1. В качестве субстрата используют АТФ, 5-АМФ и р-глицерофосфат натрия. Активность АТФазы и 5-нуклеотидазы определяют на плазматической мембране в эндоплазматическом ретикулуме и комплекте Гольджи, в ядерной оболочке, хроматине и ядерных рибонуклеопрртеидах - в ядрышках, интерхроматиновых и перихроматиновых гранулах, перихроматиновых фибрилах и клубочковидных тельцах. Отрицательная реакция с р-глицерофосфатом натрия свидетельствует о специфичности гистохимической реакции на АТФазу и 5-нуклеотидазу. Пример 2. Кусочки печени крысы толтиной 2-3 мм фиксируют 2 ч в 1,5%-ном растворе глутаральдегида на 0,067 М какодилатном буфере (рН 7,2) при 4°С, промывают в 0,1 М какодилатном буфере (рН 7,2) с добавлением 7,5%-ной сахарозы и затем инкубируют 30 мин при 37°Св следующей среде, мМ: АТФ или 5-АМФ 0,83; трисHCL - буфер (рН 7,2) 80; сульфат магния Ю; нитрат свинца 3,6. Далее образец подвергают обработке и электронномикроскопическому исследованию по общедоступной методике. Активность АТФазы и 5-нуклеотидазы определяют практически только на плазматической мембране. В редких клетках слабую активность можно наблюдать в ядрышках клеток. Кроме того, по всем клеткам наб дюдается слабый, равномерно распределенный диффузный осадок за счет высокого уровня неферментативного гидролиза субстрата до 370 согласно биохимическим определениям в среде данного состава. Изобретение позволяет повысить точность определения (доля неферментативного гидролиза, определенная биохимически, составляет по известному способу 37%, по предлагаемому - 4,4%), устойчивость (стабильность) инкубационной среды за счет введения в средус буфернойсмесью хелатирующего агента (малеата) и установления эквимолярного соотношения концентраций (по 2 мМ) ионов свинца, ионов магния или субстрата, упростить процесс, сделав возможным его использование для определения различных фосфогидролаз (АТФаза, 5-нуклеотидаза, Г-6-Ф-аза, неспецифическая фосфатаза) и проведения серийных экспериментов, а также одновременного создания дополнительных контрольных проб для каждой из фосфогидролаз, исследуемых в данной серии опытов.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОСФОГИДРОЛАЗ В ТКАНЯХ, включающий их фиксацию в буферном растворе «-формальдегида, промывку в растворе сахарозы и инкубацию в среде, содержащей исследуемый субстрат, буферный раствор, соли магния и свинца, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения фиксацию проводят в течение 1,5-2 ч в-составе, содержащем в качестве буферного раствора 0,1 М фосфатный буфер с рН 7,4при следующем соотношении компонентов, мае. %: rt-Формальдегид2,0-4,0 0,1 fA фосфатный буфер с рН 7,4Остальное а инкубацию проводят в течение 25-30 мин при 36-37°С в среде, дополнительно содержащей сахарозу, а в качестве буферного раствора - трыс-малеатный буфер с рН 7,2 при следующем соотношении компонентов, мМ: Исследуемый субстрат2-2,2 Соль магния2-2,2 Сахароза0,25-0,28 Соль свинца2-2,2 I rpwc-Малеатный буфер с рН 7,280-90 kл и по выпадению осадка определяют наличие фосфогидролаз.