Способ получения ауксинрецепторного белка из растений Советский патент 1992 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к биохимии и физиологии растений, а именно к способу получения ауксинрецепторного белка из проростков хлопчатника, который может быть использован для скрининга пестицидов ауксинподобного действия.

Известен способ выделения ауксинсвя- зывающих белков специфической культуры клеток табака, требующий для своего роста гербицид 2,4-Д, т.е. 2,4-дихлорфеноксиук- сусную кислоту, и обогащенный тип ауксин- связывающих белков, методом аффинной хроматографии на колонке с 5-гидроокси- ИУК-эпоксисефарозе (ИУК-индолилуксус- ная кислота). В результате был выделен белок с мол.мае. 150-200 кД, стимулирующий в присутствии ИУК синтез РНК в экспериментах.

Однако в нативном растении присутствует несколько ИУК-связывающих белков, в связи с чем применение одностадийного выделения не пригодно для получения ре- цепторного белка в чистом виде. Кроме того, рецептор выделен из специфической мутан- тной культуры клеток, а не из нативного растения.

Сравнительный анализ предлагаемого изобретения с другими техническими решениями показал, что в литературе отсутствуют данные по выделению и характеристике ауксинсвязывающих белков из проростков хлопчатника.

1

СО

ел

4

VJ о

Цель изобретения - повышение чистоты выделяемого белка - рецептора индолилук- сусной кислоты (ПУК) из проростков хлопчатника.

Поставленная цель достигается выделением всей суммы растворимых ауксинсвя- зывающих белков методом аффинной хроматографии на ИУК-ацетамидогексилсе- фарозе и дополнительной очисткой элюата на гидрофобной колонке с использованием в качестве адсорбента политетрафторэтилена для выделения индивидуального белка и характеристики его рецепторных свойств,

Пример.

Приготовление водного экстракта.

В работе использованы проростки хлопчатника (Gossypium hirsutum L), сорт 175-Ф. Семена обрабатывают концентрированной серной кислотой для снятия опушен- ности, замачивают в воде 12 ч и проращивают в темноте на влажной фильтровальной бумаге при 28°С 2-3 сут.

40 г этиолированных проростков измельчают ножницами и гомогенизируют в 10 объемах трис-HCI 50 мМ, рН 7,8, 50 мМ KCI. 2,5 мМ MgCl2, 5 мМ ЭДТА (этилендиа- минтетрауксусная кислота), 2 мМ дитиотре- итола, 250 мМ сахарозы, в гомогенизаторе Поттера. Гомогенизацию и все операции по выделению проводят при 2-4°С. Гомогени- зат фильтруют через слой бязи и центрифугируют 30 мин на центрифуге при 20 тыс.д., при этом осаждается фракция грубых мембран.

В супернатант объемом 430 мл добаля- ют сухой сульфат аммония до 80% насыщения, выдерживают на холоду и осадок собирают центрифугированием при 20000 д. в течение 20 мин. Осадок перерастворяют в 5 мл буфера (50 мМ трис-HCI, рН 7,8), нерастворившиеся частички удаляют центрифугированием. Супернатант, содержащий 47,8 мг белка, обессоливают на колонке (50x2,5 см) с седафексом G-25, уравновешенной 50 мМ трис-HCI, рН 7,8, и элируют тем же буфером при скорости 30 мл/ч. Белковую фракцию, выходящую в свободном объеме колонки, используют для дальнейшей работы.

Синтез аффинного сорбента.

Синтез сорбента осуществлен по известной методике. В 120 мл диоксана растворяют 2,79 г йодуксусной кислоты и 2,7 г N-гидроксисукцинимида. К полученному раствору добавляют 3,7 г N.N-дициклогек- силсукцинимида. Через 70 мин выпавший осадок дициклогексилмочевины удаляют фильтрованием. 90 мл фильтрата добавляют к 60 мл суспензии АН-сефарозы, содержащей 10-13 мкМ NH2-rpynn в 0,1 М фосфатном

буфере, рН 7,5, добавление ведут при 4°С. Для тестирования экранирования аминогрупп к аликвотам добавляют тринитробен- золсульфонат и по исчезновению

оранжевой окраски судят об окончании реакции (30 мин). Затем 60 мл йодацетоамидо- гексилсефарозы переносят на шотовскую воронку и промывают холодным раствором 0,1 М NaCI (2 л). В йодацетоамидный гель

вносят раствор ИУК-индолилуксусной кислоты в концентрации 10 М, предварительно растворенную в диметилформамиде и смешанную с 0,1 М раствором NaHCOs (рН 8,5) в соотношении 1:1. Смесь выдерживают

в течение 3 сут при комнатной температуре. В полученную ИУК-ацетоамидогексилсефа- розу добавляют 0,2 М раствор 2-аминоэта- нола для маскировки непрореагировавших йодацетильных групп. По окончании реакции (через 24 ч) аффинный сорбент промывают 0,1 М NaHCOs, рН 8,5 (3 л). Полученный сорбент содержит 10 мкМ ПУК на 1 мл геля. Схема получения сорбента следующая:

25

-кад6шг+ -

(

АН-сефарщ хСНгЗ

щад6нн-с4 0 он

йоЗацетоакиоогексилсефарош

-ЩСНг)6Ш-сЛС6 - LitjJ i|

йобацгтоамидогексип- Н сефароааШ

40

ВДСК ОгСС-ОО 3

сн

ЙУК -аигтоачиОогексилсгфароза

Выделение ИУК-связывающих белков. Белковую фракцию, содержащую 33,3 мг белка, наносят на ИУК-ацетоамидогексилсефарозный гель в колонке, размеры которой 10x2,6 см. Аффинную колонку промывают до получения элюата с постоянной оптической плотностью, при 280 нм. Элюцию связавшихся белков осуществляют

1 М NaCI, при скорости 3 мл/мин. Белковую фракцию диализуют против воды и лиофильно высушивают. Количество белка, связывающегося с ИУК-ацетоамидогек- силсефарозным гелем, составляет 4,3 мг,

что дает 9% белка от наносимого на колонку.

Характеристика ИУК-связывающих белков.

-ООценка рецепторноп связывания.

Эксперименты по связыванию проводят, используя фильтрование на нитроцел- люлозных фильтрах марки Сымпор с размером пор 0,4-0,8 мкм по известной методике. Связывание с водорастворимыми фракциями проводят в 20 мМ трис-HCI, рН 7,6. При этом используют Н-ИУК с удельной активностью 21 Ки/мМ. Для оценки уровня неспецифического связывания применяют немеченную МУК в концентрации М. Кривые связывания указывают на один тип связывающего участка с Кд 6 мМ и с плотностью связывающих участков 20 пМ/мг белка,

2) Оценка РНК-полимеразной активности.

Из проростков хлопчатника выделяют хроматин обычным способом. Для этого проростки хлопчатника гомогенизируют в буфере, содержащем 0,25 М сахарозу, 50 мМ трис-HCI, рН 7,8, 0,1 М MgCIa и 0,02 М 2-меркаптозтанол Гомогенат фильтруют через слой нейлоновой сетки и центрифугируют при 1000 д.в течение 10 мин. Осадок, содержащий ядра, ресуспендируют в буфере выделения, содержащего 1%-ный трион- Х-100, дважды промывают буфером того же состава, но без триона и центрифугируют при 20000 д. в течение 20 мин. Осадок растворяют в буфере, содержащем 50 мМ трис- HCI, рН 7,8, 0,02 М MgCte, 1 мМ 2-меркаптоэтанола и 10%-ный глицерин.

Реакционная смесь для определения РНК-полимеразной активности содержит 0,2 мМ АТФ, ГТФ, УТФ и 0,02 мМ 3(-ЩТФ с удельной активностью 20 Ки/мМ, 0,1 М KCI, 2 мМ ацетата натрия, 20 мМ трис-HCI с рН 7,8, 1 мкг, выделяемого ауксинсвязывающе- го белка, 10 мкМ ИУК и 20 мкг хроматина. Реакцию начинают внесением суспензии хроматина. Смесь инкубируют 30 мин при 20°С и останавливают добавлением 50 мкл 10%-ной трихлоруксусной кислоты. Содержимое пробирок фильтруют на фильтрах Сынпор, аналогично эксперименту по связыванию (1 г). Фильтры высушивают, поме- щают во флаконы со стандартным толуольным сцинтиллятором и измеряют их радиактивность на счетчике Бета-2.

Выделение гомогенного ИУК-связываю- щего белка с помощью гидрофобной хроматографии.

Очистку ауксинсвязывающего белка

проводят на колонке (12x1 см) с сорбентом Полихром-Г .4,3 мглиофильно высушенного белка перерастворяют в 500 мкл буфера трис-HCI 50 мМ с рН, 7,8 и наносят на колонку. Элюцию с колонки проводят этанолом

ступенчато: 20 - 40 - 60 - 80 - 96 соответственно. Профиль элюции представлен шестью пиками. Пятый пик, элюируемый 96%-ным этанолом, в присутствии ИУК стимулирует РНК-полимеразную активность в препарате хроматина и специфически связывает Н-ИУК. Получено 0,5 мг белка.

Для оценки молекулярной массы полученного белка, элюат после аффинной колонки разделяют на колонке Glas Рас. HW

- 3000 (8x300 мм) с помощью аппаратуры для высокоэффективной жидкостной хроматографии фирмы LKB. Пик с кажущейся молекулярной массой около 200 кДа, обладает РНК-полимеразной активностью. Электрофорез в ПААГ с ДДС-натрия, как для этого пика, так и для пятого пика, дает одну полосу, соответствующую мол,массе 43 кДа.

Предлагаемое изобретение позволяет впервые осуществить эффективное выделение ауксинрецепторного белка из нативно- го растения (хлопчатника), который может быть использован в качестве инструмента при проведении скрининга новых пестицидов ауксин подобного действия.

Формула изобретения

Способ получения ауксинрецепторного белка из растений, включающий получение водного экстракта растений, осаждение белков и очистку ауксинрецепторного белка

хроматографическими методами, отличающийся тем, что, с целью повышения чистоты выделяемого белка, очистку ведут методом аффинной хроматографии с использованием в качестве адсорбента

индолилуксусная кислота - ацетоамидогек- силсефароза, а затем дополнительно очищают белок методом гидрофобной хроматографии с использованием в качестве адсорбента политетрафторэтилена.

Изобретение относится к биохимии и физиологии растений. Цель изобретения - повышение чистоты выделяемого ауксинре- цепторного белка. Данная цель достигается выделением всей суммы растворимых аук- синсвязывающих белков методом аффинной хроматографии на индолилуксусной кислоте - ацетоамидогексилсефарозе и дополнительной очисткой элюанта на гидрофобной колонке с политетрафторэтиленом для выделения индивидуального белка. Ё