СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЯДЕРНЫХ ПРОТЕИНАЗ ИЗ НЕГИСТОНОВЫХ И ГИСТОНОВЫХ БЕЛКОВ РАСТЕНИЙ Российский патент 2014 года по МПК C12N9/50 

Изобретение относится к биохимии и молекулярной биологии эукариотической клетки и может быть применено к анализу молекулярно-генетических механизмов формирования структур клеточного ядра и роли белковых компонентов в их организации, что необходимо для получения дополнительной информации в разработках и построении компьютерных моделей организации генных и эпигенных сетей управления.

Известен способ [1] выделения ядерных фракций из растений, обладающих протеолитической и ингибиторной активностью. Недостатком способа является то, что активность определялась непосредственно в супраструктурах, извлеченных из клеточных ядер, без разделения на негистоновые и гистоновые белки.

Известен способ [2] препаративного выделения основных белков из супраструктур клеточных ядер растений. Недостатком этого способа является то, что полученные из супраструктур клеточных ядер гистоновые и негистоновые белки не оценивались на протеолитическую активность и не было получено методом аффинной хроматографии фракции, обладающей Арг-Х протеолитической активностью.

Известен анализ [3] Арг-Х протеолиза и его ингибирования в негистоновых и гистоновых белках супрамолекулярных структур клеточных ядер растений, в котором Арг-Х протеолитическая и ингибиторная активность определялась непосредственно в негистоновых и гистоновых белках, полученных с помощью ионообменной хроматографии на ИРЦ-50 без последующего выделения ядерных протеиназ методом аффинной хроматографии.

Вышеуказанный анализ Арг-Х протеолиза и его ингибирования в негистоновых и гистоновых белков супрамолекулярных структур клеточных ядер растений [3] был принят за основу, в котором первоначально в определенные интервалы времени от начала замачивания 0 ч, 3 ч, 6 ч, 9 ч, 12 ч, 15 ч, 18 ч, 21 ч проводят отделение зародышей от эндосперма с последующей консервацией зародышей в забуференном 80-90% глицерине при минус 25°С, выделяют клеточные ядра, проводят экстракцию ядерных фракций возрастающими концентрациями 0,14 М, 0,35 М, 2 М хлористого натрия и 6 М гуанидин гидрохлорида с 0,1% β-меркаптоэтанолом и выделяют из вышеперечисленных фракций основные белки с помощью ионообменной хроматографии с амберлитом ИРЦ-50 в прерывистом градиенте гуанидин гидрохлорида: 6%, 8,9%, 10,6%, 13%, 40% на 0,1 М калий-фосфатном буфере, рН 6,8, и определяют в них сайты Арг-х протеазо- и ингибитор-трипсиновой активности.

Цель изобретения - предлагается способ получения ядерных протеиназ из негистоновых и гистоновых белков растений.

Указанная цель достигается тем, что в способе получения ядерных протеиназ из негистоновых и гистоновых белков клеточных ядер растений первоначально в определенные интервалы времени от начала замачивания 0 ч, 3 ч, 6 ч, 9 ч, 12 ч, 15 ч, 18 ч, 21 ч проводят отделение зародышей от эндосперма с последующей консервацией зародышей в забуференном 80-90% глицерине при минус 25°С, выделяют клеточные ядра, проводят экстракцию ядерных фракций возрастающими концентрациями 0,14 М, 0,35 М, 2 М хлористого натрия и 6 М гуанидин гидрохлорида с 0,1% β-меркаптоэтанолом, выделяют из вышеперечисленных фракций негистоновые и гистоновые белки с помощью ионообменной хроматографии с амберлитом ИРЦ-50 в прерывистом градиенте гуанидин гидрохлорида: 6%, 8,9%, 10,6%, 13%, 40% на 0,1 М калий-фосфатном буфере, рН 6,8, пропускают полученные белки с помощью метода аффинной хроматографии через колонку с сефарозой 4В с иммобилизованным ингибитором трипсина с последующей оценкой протеолитической активности.

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Пример

Опыты проводили на элитных семенах пшеницы (Triticum aestivum L.) сортов Артемовка, Мироновская 808 и Мироновская яровая (любезно присланные нам из коллекции ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института растениеводства им. Н.И.Вавилова). Проращивание зародышей осуществляли в темноте при 22±1°С. В определенные интервалы времени - 0 ч (воздушно-сухое семя) и от начала замачивания семян: 3 ч, 6 ч, 9 ч, 12 ч, 15 ч, 18 ч, 21 ч проводили отделение зародышей от эндосперма. Клеточные ядра выделяли по методу [4]. Надмолекулярные структуры: нуклеоплазму (Нп), хроматин непрочно- (Хр-I) и прочно- (Хр-II) связанный с ядерным матриксом (ЯМ), а также ЯМ выделяли из очищенных клеточных ядер соответственно при повышении ионной силы раствора: 0,14М NaCl, 0,35M NaCl, 2M NaCl в 0,01М трис-HCl буфере, рН 6.8. ЯМ извлекали 6М гуанидингидрохлоридом (Gu·HCI) с 0,004%-ным β-меркаптоэтанолом в том же буфере. Полученные супраструктуры клеточных ядер пропускали через колонку с амберлитом ИРЦ-50 (полиментакриловая синтетическая смола со свободными карбоксильными группами). Смола использовалась в виде порошка, получаемого при размалывании в шаровой мельнице. Размельченная смола просеивалась через сито 200 меш, после чего многократно промывалась водой для удаления мельчайших частиц, высушивалась и промывалась ацетоном. Для достижения большей хроматографической эффективности проводили циклизацию. К 100 г смолы добавляли 500 мл 4н. NaOH, перемешивали в течение 3 ч с последующим отмыванием на фильтре водой до нейтральной реакции и переводили в кислую форму, пропуская через нее 500 мл 4 М HCl, избыток HCl удаляли промыванием водой. Этой смолой заполняли колонку размером 0,4×4,5 см. На колонку наносили белок в количестве 20-50 мкг, растворенный в 6% гуанидин гидрохлориде на 0,1 М калий-фосфатном буфере, рН 6,8. Скорость элюции составляла 6 мл/ч. Препаративное отделение основных белков протеома клеточных ядер проводили в прерывистом градиенте гуанидин гидрохлорида: 6%, 8,9%, 10,6%, 13%, 40% на 0,1 М калий-фосфатном буфере рН 6,8. Описанным выше методом удалось разделить белки супраструктур клеточных ядер на 5 фракций, которые по концентрации гуанидин гидрохлорида в элюате соответствуют фракциям: 0 - фракция, обогащенная негистоновыми белками и белками HMG; фракция, обогащенная гистоном H1; фракция, обогащенная гистонами Н2А и Н2В; фракция, обогащенная гистонами Н3 и Н4, и, наконец, фракция, содержащая остатки гистонов Н3 и Н4 с примесью белков ядерного матрикса.

Количество белка определяли по связыванию белка с кумасси ярко-синим G (Loba, Австрия) [1, 4]. Метод использовался в случае микро-наноколичественного определения белка.

Пробы, полученные в результате ионообменной хроматографии, диализовали против 0,05 М трис-HCl буфера рН 7,5 для удаления гуанидин гидрохлорида. Полноту удаления контролировали с помощью рефракторметра.

Аффинную хроматографию проводили на колонке (0,3×4 см) с иммобилизованным ингибитором трипсина, ковалентно присоединенного к CNBr-активированной агарозе (Институт химии АН Эстонии) [1]. Гель содержал 0,1 мкмоль присоединенного ингибитора трипсина. Уравновешивание колонки проводили с помощью 0,05 М трис-HCl, рН 8 (из буфера был исключен CaCl₂ вследствие того, что при последующих реакциях по определению протеолитической активности он давал осадочную реакцию). Связавшийся белок элюировали 0,1 н. Na-ацетатным буфером, рН 3. Работу колонки с иммобилизованным ингибитором трипсина проверяли пропусканием через нее чистого сывороточного альбумина (Реахим), а также альбумина с добавлением трипсина (0,5-1 мкг). Колонка не связывала чистый сывороточный альбумин, а из смеси альбумин-трипсин идентифицировала трипсин.

В полученных методом аффинной хроматографии фракциях Арг-х протеазоактивность определяли по расщеплению низкомолекулярного белка протамина («Calbiochem», США) [1] (молекула которого состоит из 33 аминокислот: 22-х молекул Arg; 4-х молекул Ser; 3-х молекул Pro; по 2 молекулы Glu и Val). Активность выражали в нмоль аргинина·с^-1·мг^-1 белка.

Ход анализа: 0,02-0,025% раствор протаминсульфата готовили на 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,0. К 0,5 мл ферментного раствора (в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,0) добавляли 0,2 мл протаминсульфата, инкубировали при 37° в течение 20 мин. Реакцию прекращали добавлением 0,7 мл 20% ТХУ (трихлоруксусная кислота). В контрольные пробы протаминсульфат вносили после добавления ТХУ. Мерой активности фермента служило количество растворимых в ТХУ аргининсодержащих пептидов, образующихся из протаминсульфата при его расщеплении трипсином или трипсиноподобными белками клеточного ядра. После добавления холодной 20% ТХУ опытные и контрольные пробы тщательно перемешивали и центрифугировали при 1500 g в течение 15 мин. Все операции проводили при 0-4°С. К 0,5 мл прозрачного центрифугата добавляли 1,25 мл 0,04% раствора 8-оксихинолина ("Реахим") (приготовленного в день опыта путем пятикратного разведения холодной дистиллированной водой 0,2% раствора 8-оксихинолина, растворенного в 96° этаноле), затем в пробу вносили 0,25 мл 10% NaOH, перемешивали и оставляли стоять в течение 2 мин, после этого добавляли 0,05 мл NaBrO (приготовленного путем растворения 1 г брома в 100 мл 5% NaOH) и через 15 с вносили 0,25 мл 40% мочевины, еще через 40 с - 2,75 мл холодной дистиллированной воды. После 5 мин стояния определяли оптическую плотность растворов при А₄₉₀ (ФЭК-56 М, СССР).

С помощью калибровочной кривой значения оптической плотности при А₄₉₀ переводили в количество нмолей аргинина в пробе. В качестве стандарта для калибровочного графика использовали D,L-аргинин ("Reanal", Венгрия).

Протеолитическую активность рассчитывали по формуле:

$$\frac{V\cdot \Delta C\cdot \mathrm{1,4}}{T\cdot V_1\cdot \mathrm{174,2}\cdot Б}=\begin{array}{c}нмольаргинина,образованногов\\ результатегидролиза1мгбелказа1с.\end{array}$$

Обозначения в формуле:

V - объем (мл) ТХУ фильтрата, взятого для диализа;

ΔС - количество аргинина в нг (в ТХУ фильтрате);

1,4 - общий объем (мл) реакционной смеси;

Т - время инкубации (с);

V₁ - объем (мл) ядерного экстракта, взятого для инкубации;

174,2 - молекулярная масса аргинина;

Б - количество белка (мг) в 1 мл ядерного экстракта.

На фиг.1 представлена эффективность экстракции супрамолекулярных комплексов возрастающими концентрациями 0,14 М, 0,35 М, 2 М хлористого натрия и 6 М гуанидин гидрохлорида с 0,1% β-меркаптоэтанолом по процентному выходу белка. На оси абсцисс обозначены выделенные супрамолекулярные структуры клеточных ядер: Нп - нуклеоплазма, Xp-I - хроматин непрочносвязанный с ядерным матриксом, Хр-II - хроматин прочносвязанный с ядерным матриксом и ЯМ - ядерный матрикс. На оси ординат показан процент выхода белка.

На фиг.2 эффективность выхода негистоновых и гистоновых белков в результате элюции супрамолекулярных структур клеточных ядер в прерывистом градиенте гуанидин гидрохлорида. Использованы следующие обозначения: Нп - нуклеоплазма, Xp-I - хроматин непрочносвязанный с ядерным матриксом, Хр-II - хроматин прочносвязанный с ядерным матриксом и ЯМ - ядерный матрикс. На оси ординат показано содержание белка на 1 ядро, пг. На оси абсцисс - концентрации прерывистого градиента гуанидин гидрохлорида с обозначением соответствующих белков: НГБ - негистоновые белки; Н1, Н2А, Н2В, Н3, Н4 - гистоны.

На фиг.3 эффективность выхода фракций, обладающих Арг-Х протеолитической активностью, с помощью аффинной хроматографии на колонке с сефарозой, иммобилизованной ингибитором трипсина. На оси ординат показано содержание белка на 1 ядро, пг. На оси абсцисс - концентрации прерывистого градиента гуанидин гидрохлорида с обозначением соответствующих белков: НГБ - негистоновые белки; HI, Н2А, Н2В, Н3, Н4 - гистоны.

На фиг.4 показана Арг-Х протеолитическая активность фракций, полученных в результате аффинной хроматографии. На оси ординат показана активность протеиназ, выраженная в нмоль аргинина на 1 мг белка/с. На оси абсцисс - концентрации прерывистого градиента гуанидин гидрохлорида с обозначением соответствующих белков: НГБ - негистоновые белки; HI, H2A, Н2В, Н3, Н4 - гистоны.

Анализ фиг.1-4 показывает, что в период перехода G₁ в S фазу клеточного цикла как в негистоновых, так и гистоновых блоках клеточного ядра локализуются комплексы, обладающие Арг-Х протеолитической активностью. Известно, что аргинин в составе белков активно участвует в процессах, структурирующих упаковку ДНК, особенно при модификации гуанидиновой группы. Сжатие или растяжение нуклеопротеидных супраструктур клеточного ядра способно экранировать гидрофобные или гидрофильные поверхности белка для межмолекулярных взаимодействий и тем самым влиять на плотность упаковки ДНК и ее транскрипционную активность.

Данное изобретение рекомендуется для анализа молекулярно-генетических механизмов, происходящих на разных уровнях пространственно-временной реорганизации интерфазного хроматина, которая способна выполнять важную роль в функционировании эпигенетических механизмов, работающих не на уровне триплетного кода ДНК, а на уровне N-концевых аргининовых и лизиновых участков, выступающих из нуклеосомной глобулы.

Источники информации

1. Иванова Э.А., Вафина Г.Х. Способ получения ядерных фракций, обладающих протеиназной и ингибирующей активностью. Авторское свидетельство 1733471 //БИ 1992. Т.18, С.96.

2. Иванова Э.А.. Вафина Г.Х. Способ препаративного выделения. основных белков из супраструктур клеточных ядер растений. Патент №2408602//Опубликовано: 10.01.2011. Бюл. №1.

3. Иванова Э.А., Вафина Г.Х. Способ выделения растительных клеточных ядер. Авторское свидетельство 1701747// Б.И. 1991. №48. С.98.

4. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985. С.342.

Изобретение относится к биохимии и молекулярной биологии эукариотической клетки. Предложен способ получения ядерных протеиназ из негистоновых и гистоновых белков растений, в котором первоначально в определенные интервалы времени от начала замачивания 0 ч, 3 ч, 6 ч, 9 ч, 12 ч, 15 ч, 18 ч, 21 ч проводят отделение зародышей от эндосперма с последующей консервацией зародышей в забуференном 80-90% глицерине при минус 25°С, выделяют клеточные ядра, проводят экстракцию ядерных фракций возрастающими концентрациями 0,14 М, 0,35 М, 2 М хлористого натрия и 6 М гуанидин гидрохлорида с 0,1% β-меркаптоэтанолом, выделяют из вышеперечисленных фракций гистоновые и негистоновые белки с помощью ионообменной хроматографии с амберлитом ИРЦ-50 в прерывистом градиенте гуанидин гидрохлорида: 6%, 8,9%, 10,6%, 13%, 40% на 0,1 М калий-фосфатном буфере рН 6,8, пропускают полученные белки с помощью метода аффинной хроматографии через колонку с сефарозой 4В с иммобилизованным ингибитором трипсина с последующей оценкой протеолитической активности. Изобретение может применяться для анализа молекулярно-генетических механизмов формирования структур клеточного ядра, что необходимо для получения дополнительной информации в разработках и построении компьютерных моделей организации генных и эпигенных сетей управления. 4 ил.

Способ получения ядерных протеиназ из негистоновых и гистоновых белков растений, включающий отделение в определенные интервалы времени от начала замачивания 0 ч, 3 ч, 6 ч, 9 ч, 12 ч, 15 ч, 18 ч, 21 ч зародышей от эндосперма с последующей консервацией зародышей в забуференном 80-90% глицерине при минус 25°С, выделение клеточных ядер, экстракцию ядерных супраструктур возрастающими концентрациями 0,14 М, 0,35 М, 2 М хлористого натрия и 6 М гуанидин гидрохлорида с 0,1% β-меркаптоэтанолом, выделение из вышеперечисленных фракций негистоновых и гистоновых белков с помощью ионообменной хроматографии с амберлитом ИРЦ-50 в прерывистом градиенте гуанидин гидрохлорида: 6%, 8,9%, 10,6%, 13%, 40% на 0,1 М калий-фосфатном буфере рН 6,8, выделение ядерных протеиназ с помощью метода аффинной хроматографии через колонку с сефарозой 4В с иммобилизованным ингибитором трипсина с последующей оценкой протеолитической активности.