Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый для получения моноклональных антител к Р @ -копропорфирину Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 A61K39/395 

Изобретение относится к гибридом- ной технологии.

Штамм получают следующим образом.

Для иммунизации используют конью- гат Pd-копропорфирина I с бычьим сывороточным альбумином. 4-недельных мьшей линии Balb/c иммунизируют в течение месяца 3 раза 30 мкг антигена. При первой инъекции раствор антигена суспендируют в равном объеме адьюванта Фрейнда, последующие инъекции проводят без него. Титр антител в сыворотке крови животных, определяемый методом ELISA, составляет 1:15000. За 4 дня до слияния мьшей иммунизируют раствором антигена в физиологическом растворе. Через 4 дня у мыши извлекают селезенку в стерильных условиях, гомогенизируют в физиологическом растворе, содержащем

10% глюкозу, и оставляют стоять 3 мин. Грубый ослдок отбрасывают, а взвесь клеток переносят в центрифужный стакан и центрифугируют 8 мин при 800 g. Надоеадочную жидкость отбрасывают, а осадок суспендируют в 50 мл физиологического раствора, содержащего глюкозу, снова центрифугируют в тех же условиях. Эту операцию повторя- ют 2 раза.

Аналогичным образом промывают 3 раза физиологическим раствором ми- еломные клетки мыши линии Sp2/0. После этого селезеночные клетки смеши-- вают с миеломными в соотношении 10:1 . и осаждают их центрифугированием. Надоеадочную жидкость сливают и к осадку медленно по каплям добавляют 1 мл 50%-ного полиэтилекгликоля в физиологическом растворе, содержащего 10%

СП

О №

СО СП

09

диметилсульфоксида„ Через 3 мик медленно в течение 5 мин добавляют физиологический раствор, содержащий глюкозу, до объема 50 мл. Клетки оca дают центрифугированием и осадох суспендируют в среде Игла, модифицированой Дульбекко (ДНЕМ), содержащей 0% сыворотку крови оленей, 3,5 мМ глют

амин, 17,5 мкМ пируват катрич, 50 мк 2-меркаптоэтанол, 100 мкМ гипоксан

тин, 16 мкМ тимидиНу 0,4 мкМ амияоп- терин. Клетки распределяют в пяти 96- луночных микропланшетех и культивируют в С0г-инкубаторе по ч 37 С в т мосфере 5% С05 ° Через 3 дней клетки подкармливают9 убирая из каждой лун- ки 50 мкл среды и добавляя 50 мкл свежей о

Через дч-зе недели после слияния проводят тестирование гибридом ча пэ- личие монокловальных антител методом непрямого твердофазного чммунофег)- ментного анализа, используя для еорб дай на полистироловых мккролланше- так коньюгат Рс1--копропоофири ш с сое вым ингибитором трипсиня о Клетки2 положительные яо результатам тестировании, помещают в среду, сидепжащмо все указанные компоненты, за исключением аминоптерина (НТ-сосдаЧ Клетки наращивают в 24 дуночник микропланшет ах, часть из них замораживают, а остальные клонируют в полужидком агаре, Клонирование гибридочы повторяют трижды. Клонтюванчую гибридому перевивают на мьшгах Balb/c с цглыо получения асцитнои л.идкост::

Полученный штамм гибридных клеток ЗД, 6E,2GS синтезирующий моноклоналъ- ные антитепа к Pd-копроггорфирину, депонирован в спецчализкрованной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюг. коллекции клеточных культур Института отологии АН СССР под НВСКК(П) 256Д и характеризуется следующими свойствами. Культуральные свойства. Для вырмцивания штамма используют культуральные флаконы. Во флакон объемом 25 мл в 3 мл среды ДНЕМ, содержащей 10% фетальной сыворотки., 3,5 мМ глютамин, 17,5 мкМ пирува1 натрия, засевают 230000 клеток гнгбри- домы 3D.6E.2G и проводят пассажи 1 раз в 4-5 дней с подсчетом клеток, Для получения асцита мышам Balb/c зз 7 дней до введения гибридомных клеток вводят 0,5 мл 2, 6„ 10, 14-тетра

метилпентадекана в/б. На 7 день штамм клеток инъецируют в/б в количестве 500000 клеток в мышь, Асцитную жидкость отбирают на 12-14 день. Объем асцита 4-5 мл. Клетки из асцита -перевиваются новым мышам в течение 8- 10 пассажей без гаметного изменения титра моноклонапьных антител в асцитной жидкости,

1

Продуктивность штамма.

Концентрация моноклональных антител в культуральной жидкости на 7 цень культивирования 100 нкг/мл, а в ас щтной жидкости 10-12 мг/мл при определении по методу Лоури и методом твердофазного иммуноферкентного ала- л:тза0

. Контамгшация: бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Тест на ми коплазму отрицателен.

Кариологическак характеристика штамма; модальное шсло хромосом 100, Мэркерньх хромосом не выявлено.

Криоконсервирозание, ТСлетки мэ (500 тыс/мл) ресуспендируют в смеем, содержащей 30% эмбриональной телячьей сыворотки, 10% диметилсуль- фоксцца., 60% ДЭДЗМ при , затем раз- ливагот з пластиковые ампулы и помещат 1от в контейнеры из полиуретана. Контейнеры переносят в холодильник на -70 С на 24 ч„ Затем клетки переносят в жидкий азот на длительное хранение Размораживание проводят в водяной бале при 37°С. Жизнеспособность клеток 70%.

Характеристика полезного продукта,

Моноклональные антитела относятся к IgG I -подклассу иммуноглобулинов. Изоэлектрическая точка по основной полосе соответствует 6,8.

Аффинную константу определяют сле- дующим образом

R лунках 96 луночного микропланшета из полистирола иммобилизованы аффиино очищенные моноклональные антитела о К ним добавляют одновременно различные концентрации копропорфири- на 1 и постоянная концентрация конью- гата копропорфирина 1 с пероксидазой в ФБРТ. Коньюгвт получен присоединением порфирина к белку с помощьг/ 1- циклогексил-3-(2-морфолиноэтил) кар- бодиимцаа-п-толуолсульфоната. Реакционную смесь инкубируют 1 ч при 37 Сэ затем ее переносят в пробирки и оценивают количество несвязавшегогО

ся с моноклональыыми антителами ко- пропорфирина 1 спектрофотометри- чески.

Константа диссоциации оавна 4,8 .

Специфичность мояоклональных антител оценивают методом твердофазного кммуноферментного анализа в следующей системе,

Очищенные методом жидкостной хроматографии высокого давления моно- клональные антитела адсорбируют на поверхности полистирола. Затем к адсорбированным антителам добавляют изменяющиеся концентрации порфиринов и постоянную концентрацию Pd-копро- порфирина I. меченного пероксидазой (1 ,56- 0- °М) в ФБРТ. Различные пор- фирины раститровывают от а белковые коньюгаты порфирина - от 10 до 10 М. В качестве контроля служат лунки с Pd (2+) копропор- фирин-пероксидазой и буфером Концентрации, при которых наблюдается 50% ингибирование, связывание конью- гата Pd (2+) копропорфирин I перок- сидаза со свободным Pd (2+) копропор фирином I и его производными, следующие, М: Pd-копропорфирин L 2,69к Zn-копропорфирин I ,32--10 5; копропорфирин I 3,16-10 ; копропорфирин III 1,66-10 ; цикло-Pd-Konpo- порфирин 6,31 10 ; гематопорфирин 1 Pd-копропорфирин I --соевый .ингибитор трипсина 2,39-10 ; Pd-копропорфирин I - бычий сывороточный а альбумин 1,69 .

Как видно из приведенных данных, антитела с высоким сродством связыва- ются со свободным Pd (2+)-копролорфи- рином. Замена атома Pd (2+) на атом Zn () ухудшает связывание в 1000 раз, а с копропорфирином без металла связывание уменьшается в 100 раз. Менее прочное связывание моноклональ- ньгх антител с копропорфирином III, циклическим копропорфирином, гематопорфирином IX и протопорфирином IX свидетельствует о том, что монокло- нальные антитела чувствительны к природе боковых заместителей порфирино- вого кольца.

Пример. Моноклональные антитела, синтезированные штаммом 3D, 6Е, 2G, используют для разработки схемы фосфоресцентного иммуноанализа инсулина. Для этого смесь моноклональных антител к инсулину ()

с инсу15

М, 20

25- 30J5

40 45 лином 0, - 5-Ю-1 инкубируют в лунках микропланшета с предварительно адсорбированным инсулином в течение 1 ч при 37°С в ФБРТ. В качестве контроля служит микропланшет, на поверхности которого адсорбирован бычки сывороточный альбумин. Затем планшеты отмывают ФБРТ и инкубируют в течение 1 ч с кроличьими антимышиными антителами () и насыщающей концентрацией комплекса моно- клональные антитела - Pd (2+)-копропорфирин I. После отмывания сорбированного на полистироле комплекса проводят его десорбцию и измерение фосфоресценции.

Минимальная концентрация инсулина, определяемая в данной схеме, приблизительно равна 2-10rf M.

Минимальная концентрация инсулина, определяемая с помощью иммуно- лероксвдазного ПАП метода соответствует при одинаковых условиях проведения анализа.

Использование гибридомы позволяет получать Моноклональные антитела, специфичные к Pd-копропорфирину.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus БСКК(П) 256Д, используемый для получения мо- коклональных антител к Pd-копропорфирину.

Изобретение относится к гибридомной технологии. Штамм получен при гибридизации клеток селезенки мышей BAL в/с, иммунизированных коньюгатом "PD-копропорфирин 1-альбумин" с клетками мышиной миеломы SP 2/O-AG 14. секретирумые клетками штамма моноклональные антитела обладают высокой аффиностью K_D 4,6 ^. 10^-1° M по отношению к PD-копропорфирину 1, что дает возможность использовать их в иммунофосфоресцентном анализе в модификации "порфирин-антипорфирин". Штамм культивируется в стандартных условиях и может перевиваться в виде асцита. Штамм депонирован под номером ВСКК/П/ N256д. продуцируемые моноклональные антитела относятся к YGG 1 подклассу. Продуктивность в культуральной жидкости на 7 день культивирования 100 мкг/мл, в асците 10 - 12 мг/мл.