Способ определения трипсина в дуоденальном содержимом Советский патент 1992 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимической диагностике хронического панкреатита на основании определения активности трипсина в дуоденальном содержимом.

Известен способ исследования трипсина в дуоденальном содержимом Бальцера и Вернера, основанный на определении количества щелочи, нейтрализующей продукты, образующиеся при ферментативном расщеплении казеина дуоденальным соком.

Однако титриметрическое определение количества щелочи связано с неточностями, что делает метод недостаточно воспроизводимым.

Известен также метод определения трипсина в дуоденальном содержимом по Кунитцу в модификации М.П. Черникова, основанный на определении степени трипти- ческого гидролиза казеина по поглощению в ультрафиолетовом свете продуктов гидролиза, не осажденных ТХУ кислотой. Данная методика трудоемка, требует применения специального оборудования (сосудов для проведения энзиматической реакции спектрофотометра), недостаточно точна и воспроизводима. Активность трипсина при этом выражена в условных единицах.

Известен способ определения трипсина в дуоденальном содержимом, основанный на расщеплении трипсином синтетического субстрата N-бензоил D-ap- гинин-пара-нитроанилина (БАПНА) в модификации В.А. Шатерникова, касающийся применения вместо трис-буфера веронало- вого буфера.

Однако определение трипсина данным методом связано с трудностями, т.к. установление концентрации пара-нитроанили- на в мутном дуоденальном содержимом часто невозможно. Рекомендуемая В.А. Ша- терниковым концентрация веронала близка к насыщенному раствору, в результате чего веронал легко выпадает в осадок, придавая мутность раствору, что также затрудняет фотометрию. Кроме того, фотометрия на двух волнах сопряжена с неточностями. Поэтому, несмотря на специфичность субстрата (БАПНА). воспроизводимость и точность метода определения трипсина недостаточсл

с

ч

-К

о

00

на. Недостатком является также и то, что активность фермента в этом методе выражается в условных единицах,

Целью изобретения является повышение точности способа.

Указанная цель достигается тем, что в качестве субстрата-белка используют фибриноген с последующим добавлением тромБина, а концентрацию трипсина определяют по пробе, в которой впервые появился фибриновый сгусток, путем сравнения ее с контролем.

Способ осуществляют следующим образом.

Реактивы: 1)0,1 М фосфатный буфер рН 7,0; 2) фибриноген 100мг растворить в 10 мл фосфатного буфера рН 7,0 при 37°С, добавляя по частям растворитель; 3) соевый ингибитор трипсина 8,5 мг растворить в 5 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 7,0, в 2 раза разбавленного 0,15 М раствором NaCI; 4) тромбин 10 мг растворить в 2 мл 0.15 М NaC, отцентрифугировать и разбавить еще в 5 раз 0,15 М NaCI; 5) дуоденальное содержимое отцентрифугировать и разбавить ба- зальный секрет в 20 раз и брать в тест в количестве от 0,05 до 0,025 мл, стимулированный секрет - в 50 раз и брать в тест в количестве от 0,1 до 0,025 мл.

Оборудование; водяная баня.

Постановка теста. В 8 пробирок вносят по 0,5 мл раствора фибриногена и разведенное базальное дуоденальное содержимое в количестве 0,05; 0,04; 0.03 и 0,025 мл; стимулированное дуоденальное содержимое в ко- личестве 0,1; 0,075; 0,05 и 0,025 мл. Затем пробирки ставят в водяную баню при 37°С на 15 мин, после чего вносят по 0.1 мл соевого ингибитора трипсина, держат на холоде в течение 10 мин и добавляют по 0,1 мл раствора тромбина, помещают на 30 мин в водяную баню при 37°С. После этого осуществляют визуальное наблюдение.

В опытах с модельными системами (вместо дуоденального содержимого вноси- лись различные количества кристаллического трипсина) установлено, что критическая концентрация трипсина, при которой выпадает мельчайшая фибриновая муть, составляет 0,8 мкг/мл. Таким образом, учитывая разведение дуоденального содержимого, можно рассчитать концентрацию трипсина. Например, базальный секрет был разбавлен в 20 раз. В тест взяты следующие количества: 0,05; 0,04; 0,03 и 0,025 мл. При 0.03 мл появилась фибриновая муть, что соответствует 0,8 мкг, В 0,03 мл исходного дуоденального содержимого содержится 0,8 20 16 мкг, а а 1 цп 533 мкг. Следовательно, концентрация трипсина в исследуемом дуоденальном содержимом составляет 533 мкг/мл.

Пример 1. Больная П., диагноз : хронический панкреатит, хронический гаст- родуоденит. Активность трипсина в базаль- ной порции дуоденального содержимого составила 400 мкг/мл (дуоденальное содержимое разведено в 20 раз, выпадение фиб- риновой мути произошло при внесении 0,04 мл разведенного дуоденального содержимого). Активность трипсина в стимулированном секретином и панкреозимином секрете (дуоденальное содержимое разведено в 50 раз, выпадение фибриновой мути произошло при внесении 0.05 мл разведенного дуоденального содержимого) составила 800 мкг/мл.

Пример 2. Больной М., диагноз: хронический холецистит, хронический гаст- родуоденит. Активность трипсина в базаль- ной порции дуоденального содержимого составила 533 мкг/мл (дуоденальное содержимое разведено в 20 раз, выпадение фибриновой мути произошло привнесении 0,03 мл дуоденального содержимого). Активность трипсина в стимулированном секретином и панкреозимином секрете (1 кд/кг массы тела внутривенно струйно) составила 1600 мкг/мл (дуоденальное содержимое разведено в 50 раз, выпадение фибриновой мути произошло при внесении 0,025 мл разведенного дуоденального содержимого).

По предлагаемому способу проведено 100 исследований активности трипсина в дуоденальном содержимом. Приводятся данные, характеризующие воспроизводимость полученных результатов предлагаемым методом и прототипом.

Воспроизводимость результатов оценивали с помощью коэффициента вариации:

П

где х - результат отдельного определения;

х - средняя арифметическая;

п - число определения;

S - среднеквадратическое отклонение.

При исследовании образца дуоденального содержимого предложенным методом определена активность трипсина, мкг/мл.

При исследовании образца дуоденального содержимого методом прототипа получены результаты, представленные в табл.2.

Таким образом, из приведенных данных видно, что точность (воспроизводимость)

предлагаемого метода выше, чем прототипа.

Статическим критерием правильности является степень отклонения средней арифметической от должного значения. Для определения правильности предлагаемого метода использован способ добавки - внесения в биологическую жидкость точно взвешенного количества анализируемого вещества и определения его с помощью исследуемого метода. Для этого в пробирку внесено 10 мг кристаллического трипсина, добавлено 10 мл 0,15 М NaCI. При этом получен раствор трипсина концентрации 1000 мкг/мл. Результаты определения активности трипсина в данной пробе предлагаемым методом представлены в табл.3.

ны

Процент отклонения от заданной величи- (эадэн. вел ич.) - (факт ич. вел.) х % (задэн. велич.)

1ППП-Qfin

ЖГ 10° У° 4°/0i Таким обРазом

отклонение от заданной величины составляет всего 4%

Предлагаемый способ определения трипсина в дуоденальном содержимом позволяет получать результаты с достаточной воспроизводимостью. Способ достаточно прост, доступен, может быть широко использован в профильных учреждениях и не требует применения дефицитных реактиBOB, специальной аппаратуры.

Формула изобретения Способ определения трипсина в дуоденальном содержимом путем взятия пробы, ее разведения, инкубации с субстратом и

оценки результатов, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа готовят несколько проб с различным разведением, в качестве субстрата используют фибриноген с последующим добавлением тромбина, а концентрацию трипсина определяют по пробе, в которой впервые появился фибриновый сгусток, путем сравнения ее с контролем.

Таблица 1

Использование: медицина, биохимическая диагностика хронического панкреатита. Сущность изобретения: готовят несколько проб с различным разведением, в качестве субстрата используют фибриноген с последующим добавлением тромбина. Концентрацию трипсина определяют по пробе, в которой впервые появился вибри- новый сгусток, путем сравнения ее с контролем. 3 табл,

П р и м е ч а.н и е. 830 мкг/мл; S 39,7: V 4.8 %.

Примечание. х 320 мед/мл; S 28,6; V 8,9 %.

Продолжение табл. 1

Таблица 2

Продолжение табл. 2

Примечание. х 960 мкг/мл; S 82,1.

Таблица 3

Продолжение табл. 3