Способ получения рекомбинантов у томатов Советский патент 1992 года по МПК A01H1/06 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетике растений, и может быть использовано в сельском хозяйстве для увеличения генотипической изменчивости растений в селекционно-генетических работах.

Цель изобретения - увеличение частоты рекомбинаций и разнообразия рекомбинан- тов.

Способ заключается в том, что обработке подвергают внутривидовые гибриды FI, в фазе ранней бутонизации 1-й кисти их заражают нулевым штаммом вируса табачной мозаики, отбирают плоды, завязавшиеся из бутонов, в которых мейоз протекал в интервале 4-6 дней после появления первых симптомов болезни, выделенные из них семена используют для посева и отбирают рекомбинантные растения с хозяйственно-ценными признаками.

Данный способ позволяет увеличить количество рекомбинаций (увеличивается частота мейотического кроссинговера на 200%

и выход рекомбинантных форм по сегменту 2-й хромосомы на 64-137%), а также разнообразие (спектр) рекомбинаций.

Способ осуществляют следующим образом.

Растения заражают в фазе ранней бутонизации первой кисти путем механической инокуляции, заключающейся в натирании листьев соком больных растений с добавлением карборунда.

У зараженных растений через 5-7 дней в мейотических бутонах обнаруживают вирусные частицы, а через 9-12 дней появляются симптомы заболевания на листьях верхних ярусов. Наиболее существенное увеличение выхода рекомбинантных форм у вирус-инфицированных гибридов наблюдается в потомстве, полученном из бутонов, прошедших стадию мейоза в интервале 3-6 дней после появления симптомов болезни. Плоды, образовавшиеся из этих бутонов, этикитируют и убирают. Выделенные семе(/

С

g

1

4

на высевают для размножения и отбирают рекомбинанты.

Пример 1. В опыте используют внутривидовой гибрид Fi между мутантами

393 и 5(М, маркированными соответственно

-j.j. по 2-й и 6-й хромосомам (-д- С М -

Опытные растения заражают в фазе ранней бутонизации 1-й кисти. Момент обнаружения вирионов в пыльниках томата устанавливают путем исследования отобранных через каждые 12 ч образцов методом имму- носорбентной электронной микроскопии. Динамика накопления инфекционных вирусных частиц в тычинках была выявлена биологическим тестированием.

Были этикитировэны бутоны: вирионы ВТМ-0 проникали в предмейотической стадии; вирионы ВТМ-0 проникали в профазе мейоза; вирионы ВТМ-0 проникали на по- стмейотических стадиях.

Контролем служат растения, обработанные дистиллированной водой и дающие от- рицательные результаты на тесты по обнаружению вирионов ВТМ-0 в период сбора спелых плодов.

Для каждого варианта определяют частоту хиазм. Частоту кроссинговера по маркированным сегментам хромосом устанавливают при оценке потомства самоопыления внутривидового гибрида FI. Ведут учет завязываемое™ плодов, их веса, осемененности и всхожести семян. Аналогичные исследования проводят на протяжении месяца через каждые три дня, начиная с момента обнаружения вирусных частиц в тычинках.

Установлено, что в мейотических бутонах интактные вирусные частицы обнаруживаются уже на 6-7-й день после инокуляции. В течение первых 2-3 дней количество частиц резко возрастает, после чего остается примерно на одном уровне.

Уровень рекомбинаций зависит от динамики накопления вирионов в тычинках, наибольшая цитогенетическая активность отмечается начиная с 9-12-го дня после заражения. Она выражается в резком повышении частоты интерстициальных хиазм на материнскую клетку пыльцы: 0,07-0,10 против 0,02-0,03 в контроле. Этот пик длится 5-6 дней, после чего наблюдается спад.

Уровень рекомбинаций в дальнейшем снижается.

Данные изменения частоты рекомбинаций у пораженных растений в зависимости от времени, прошедшего после заражения, представлены в таблице.

Пример 2. Апробация способа индуцирования рекомбинаций у томата с помощью вируса табачной мозаики.

Используют FI и Рг между сортами Ликурич и Призер.

Растения FI заражают в фазе ранней бутонизации первой кисти. На протяжении 6 дней с момента появления первых симптомов заболевания этикитировали бутоны, находившиеся на стадии мейоза. Семена, выделенные с этикитированных плодов, служат опытным материалом, а контрольным материалом - семена, выделенные из плодов, завязавшихся на здоровых растениях одновременно с опытными,

При работе с Рз каждое растение служит источником получения как контрольного, так и опытного вариантов. Получают их следующим образом. Растения заражают в фазе ранней бутонизации 2-й кисти. Бутоны, в которых мейоз протекал до инокуляции, служат для получения семян для контрольных вариантов, бутоны, в которых мейоз протекал в интервале 5 дней с момента появления

симптомов заболевания, - для опытных.

Выделенные опытные в контрольные партии семян высевают-в поле и проводят морфофенологический, биохимический и фоновый анализы.

Биометрические измерения касались таких признаков, как высота растений, количество листьев, кистей, завязавшихся товарных плодов на главном стебле и в целом на растении, вес плодов с 1-й, 2-й кисти и с

растения, средний вес и осемененность плодов. Потомство, полученное от гибридов FI, оценивается также на содержание сухих веществ общего сахара, витамина С и титруемую кислотность в плодах.

В результате установлены существенные отклонения от нормы по целому ряду показателей: высота растения, количество листьев на главном cteGne, количество кистей на главном стебле, количество плодов на

1-й кисти и т.д.).

Количество признаков, по которым установлено достоверное отклонение от нормы, зависит от генотипа растения.

Выявлено, что вирусная инфекция приводит к расширению или сужению спектра изменчивости. В популяциях, полученных от пораженных родителей, появляются (или исчезают) классы как с максимальными, так и минимальными значениями анализируемых признаков (количество плодов на 1-й кисти, количество кистей на растении, урожайность в поколении гибридов F2 томата, пораженного ВТМ-0). Появляются формы, редко встречаемые в контроле. Так, с одного

и того же растения Fa в потомстве, полученном из бутонов, в которых мейоз протекал до заражения, частота встречаемости подобных растений 0,9%. Из бутонов, в которых мейоз протекал в интервале 3-6 дней после заражения, 12,4%.

Способ позволяет увеличить количество рекомбинаций (частота мейотического крос- синговера увеличивается на 200%, выход рекомбинантных форм по некоторым сегментам хромосом - на 64-137%). Формула изобретения Способ получения рекомбинантов у томатов, включающий обработку расте0

ний. отличающийс , что, с целью увеличения частоты рекомбинаций и разнообразия рекомбинантов, обработке подвергают внутривидовые гибриды FI, в фазе ранней бутонизации первой кисти их заражают нулевым штаммом вируса табачной мозаики, отбирают плоды, завязавшиеся из бутонов, в которых мейоз протекал в интервале 4-6 дней после появления первых симптомов болезни, выделенные из них семена используют для посева и отбирают рекомби- нантные растения с хозяйственно-ценными признаками.

Использование: сельское хозяйство, способы селекции и генетики овощных культур. Сущность изобретения: внутривидовые гибриды FI в фазе ранней бутонизации 1-й кисти заражают нулевым штаммом вируса табачной мозаики. Отбирают плоды, завязавшиеся из бутонов, в которых мейоз протекал в интервале 3-6 дней после появления первых симптомов болезни. Из полученных плодов выделяют семена и используют их для посева. Отбирают рекомбинантные растения с хозяйственно-ценными признаками 1 табл.