Штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент термолабильного энтеротоксина Советский патент 1992 года по МПК C12N1/20 A61K39/108 

Изобретение относится к микробиологии, а именно к биотехнологии, и может быть применено в технологическом процессе получения термолабильного энтеротоксина как антигена, необходимого для иммунологической диагностики колиинфекций с использованием реакции двойной диффузии в геле по Ouchterlony или других методов/

Известен штамм Vibrio cholerae, Type Inaba 569 В, наиболее часто используемый в лабораторных условиях для получения термолабильного энтеротоксина и выбранный за прототип. Для получения целевого продукта штамм культивируют на жидких питательных средах, биомассу осаждают центрифугированием, а из надосадочной жидкости извлекают энтеротоксин.

Недостатком известного штамма является высокая вирулентность, требующая выполнения особого противоэпидемического режима, что препятствует широкому использованию его в технологическом процессе производства термолабильного энтеротоксина.

Целью изобретения является новый штамм E.coli, обладающий стабильным свойством интенсивно синтезировать термолабильный энтеротоксин, для использования его в технологическом процессе производства термолабильного энтеротоксина как антигена.

Штамм E.coli выделен из клинического материала больного диареей, депонирован в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича, код № 193.

Свойства штамма E.coli 193.

Морфологические признаки. Грамотри- цательные палочки спор не образуют, елабоподвижные. При электронной микроскопии представляют собой палочки с закругленными концами длиной 1,53±0,21 мкм при tp 95%; 1,53±0,3 мкм при tp 99%; ширина 0,9±0,08 мкм приtp95%; 0,9±0,12 мкм npntp99%.

Культуральные признаки. На мясо-пеп- тонном бульоне вызывают равномерное помутнение среды. На слабощелочном агаве- полупрозрачные гладкие светло-серые коло- нии диаметром 1,0-1,5 мм. На среде Эндо образуют розовые с металлическим Эндо образуют розовые с металлическим блеском колонии диаметром 1,5-2 мм, без признаков диссоциации.

Физиологические признаки. Штамм расщепляет глюкозу, лактозу, маннит, сахарозу, мальтозу и ксилозу до кислоты и газа; арабинозу и дульцит расщепляет до кислоты со слабым образованием газа. Признаки уреазной активности и продукции сероводорода отсутствуют. Индолообразование замедленное на 3 - 5 сут. Не утилизирует цитрат, малонат, не имеет фенилаланин-де- заминазы; дает положительную реакцию с метиловым красным и отрицательную Фо- геса-Проскауэра; обладает лизиндекар- боксилазной активностью, орнитинде- карбоксилаза отсутствует.

Чувствительность к антибиотикам. Определена по результатам исследования методом стандартных дисков. Штамм чувствителен к мономицину, стрептомицину, левомицетину, канамицину и гентамици- ну, Штамм устойчив к неомицину, эритромицину, метициллину, тетрациклину, ристомицину, полимиксину, пенициллину, оксациллину, карбенициллину, олеандоми- цину, ампициллину, линкомицину, фузиди- ну, доксациклину.

Антигенная структура. Серотипирова- ние штамма проведено с помощью поливалентных агглютинирующих эшерихиозных сывороток (ОКА, ОКБ, ОКС, ОКД, ОКЕ), диагностических агглютинирующих эшерихиозных адсорбированных 0-сывороток и агглютинирующих ОК-сывороток. Результаты представлены в табл.1 и 2.

Развернутая агглютинация проведена с сывороткой 0114К90 (с диагностическим титром 1:1600) культура живая. При этом агглютинация оценена на:|Јвтитре 1:1600. Проведена агглютинация прогретой культуры с сывороткой 0114, Реакция агглютинации выражена в титре 1:1600 на $t и-ж-.

Культура Е.соН 193 серотипирована как E.C01I0114K90.

Вирулентные свойства, 1.Д50 составляет 4,0 млрд.микробных тел.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1. Для продукции термолабильного энтеротоксина применяют пита- тельную среду следующего состава, мл:

Мясо-пептонный

бульон1000 мл

Глюкоза 40%-ный

водный раствор6,25 мл

0 Линкомицин 30%-ный

водный раствор0,33 - 0,26 мл

Комплекс микроэлементов1,0 м-0,5 мл

Способ приготовления среды: к сте- 5 рильному мясо-пептонному бульону асеп- тично добавляют раствор глюкозы, простерилизованный на водяной бане в течение 30 мин, линкомицин (для усиления токсинопродукции) и смесь микроэлемен- 0 тов (в 50 мл стерильной дистиллированной воды растворяют навеску следующих реактивов: 0,5 г MnCIa, 0,5 г , 5,0 г MgS04 и 0,55 мг 2%-ного водного раствора H2S04, после полного растворения реактивов объ- 5 ем доводят до 100 мл дистиллированной водой).

Биомассу культивируют 18 - 24 ч в термостате (37°С), по окончании культивирования культуру инактивируют азидом натрия 0 (1:1000) и после 30-минутной экспозиции при комнатной температуре осаждают центрифугированием при 5 тыс,об/мин в течение 25 - 30 мин при 4°С. Осадок ресуспендируют в 0,01 М трис-HCI буфере и 5 дезинтегрируют на ультразвуковом дезинтеграторе при ампитуде 20 кГц в течение 7-10 мин. Обломки бактериальных клеток осаждают центрифугированием при 12 тыс. об/мин втечение 10мин. Супернатант 0 содержит термолабильный энтеротоксин. Хроматографически чистый энтеротоксин получают методом аффинной хроматографии и гель-фильтрации на колонке с сефак- рил S 200.

5 Характеристика термолабильного энтеротоксина: препарат очищенного термолабильного энтеротоксина изучен методом дискэлектрофореза в полиакриламидном геле в сравнительных опытах с холерогеном 0 (Cholera toxin, Vibrio cholerae, Type Inaba 569B, Calblochem), При этом установлено, что по электрофоретической подвижности термолабильный энтеротоксин E.coli 193 не отличается от холерогена, имевшего мол.м. 5 84000.

П р и м е р 2. Термолабильный энтеротоксин штамма E.coli 193 использован в качестве антигена в реакции двойной диффузии в геле по Ouchterlony для обнаружения специфических антител в сыворотке

крови, копрофильтратах или другой биологической жидкости.

В центральные лунки штампов пластин вносят 25 мкл антигена (термолабильный энтеротоксин), в периферические растит- рованный исследуемый материал (сыворотка, копрофильтрат и др.) Исследуемый материал титруют в физиологическом растворе с кратностью 2, т.е. цельный 1:2, 1:4, 1:8,1:16,1:32. Пластину помещают во влаж- ную камеру на 18 - 24 ч. По истечении указанного срока проводят учет. За титр реакции принимают то разведение сыворотки или другого исследуемого материала, при котором отчетливо видна линия преци- питации.

Серологическая актвность с антитоксической сывороткой хроматографически чистого термолабильного энтеротоксина в РДДГ составляет 1:32„ биологическая активность в тесте отека лапки белой мыши - 89 мг.

П р и м е р 3. Изучение интенсивности токсинопродукции штаммом E.coli 193 проведено в сравнении с эталонным штаммом E.coli 0/148: Н287а.

В колбы объемом 3 л, содержащие по 300 мл питательной среды, вносят по 30 мл инокулянта, предоставляющего собой смыв суточной агаровой культуры, содержащей 5-6 млрд м.т. на 1 мл. Колбы устанавливают на электромагнитные мешалки втермостате и перемешивают при скорости вращения электромагнита 50 об/мин. Через 18ч культивирования культуру инактивируют азидом натрия (1:10000) и через 30 мин биомассу осаждают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 25 - 30 мин при 4 С. Осадок ресуспендируют в 30 мл 0,01 М трис-HCI и дезинтегрируют на ультразвуковом дезинтеграторе при амплитуде 20 кГц в течение 7-10 мин.

Обломки бактериальных клеток осаждают центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант, представляющий собой лизат бактериальных клеток (ЛБК), содержащий термолабильный энтеротоксин подвергают исследованию.

Результаты сравнительного изучения интенсивности токсинопродукции штаммов E.coli 0148 и E.coll 193 представлены в табл.3.

Таким образом, как следует из данных табл.3, штамм E.coli 193 обладает более выраженной токсинопродукцией по сравнению с эталонным штаммом E.coli 0148.

П р и м е р 4. Изучают способность штамма E.coli 193 стабильно продуцировать термолабильный энтеротоксин. С этой целью штамм подвергают исследованию в динамике в течение 17 мес.

Результаты исследований представлены в табл.4.

Как видно из табл.4 по определению биологической активности в тесте отека лапки белой мыши и серологической активности в РДДГ с антитоксической сывороткой штамм сохраняет способность к токсинопродукции в течение 17 мес.

Таким образом, штамм E.coli 193 является стабильным продуцентом термолабильного энтеротоксина (антигена), что может быть использовано в промышленном производстве термолабильного энтеротоксина как антигена, необходимого для иммунологической диагностики колиинт фекции.

Формула изобретения Штамм бактерий Escherlchla coli TUCK № 193-продуцент термолабильного энтеротоксина.

Использование: медицинская микробиология, получение термолабильного энтеро- токсина, иммунологическая диагностика колиинфекций. Сущность изобретения: получен новый штамм Escherichla еоН, стабильно синтезирующий термолабмльмый энтероток- син. Штамм E.coli выделен от больного с диареей, сератипироаан как 0 114 К 90, депонирован под № 193 в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских, биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича. При использовании.штамма № 193 получают термолабильный энтеро- токсин, используемый в качестве антигена в диагностических препаратах. 4 табл.,4 пр.

Результаты реакции агглютинации на стекле штамма E.coll 193 при различных условиях хоанения

Таблица 1

Результаты развернутой реакции агглютинации Е.соН 193 при различных условиях хранения

Показатели биологической и серологической активности ЛБК

Число опытов для каждого штамма составляет 6. Среднеарифметические титры.

Стабильность токсинопродукции штаммом Е.соН 193

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4