ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI РНМВ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ПУШНЫХ ЗВЕРЕЙ ОТ ТОКСИКОЗОВ, ВЫЗВАННЫХ ЭНТЕРОТОКСИНАМИ КИШЕЧНЫХ БАКТЕРИЙ, И ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ НА ЕГО ОСНОВЕ Российский патент 2005 года по МПК A61K39/108 C12N1/02 C12N15/31 

Изобретение относится к генетической инженерии и биотехнологии и может быть использовано в ветеринарии для защиты норок от энтеротоксикозов.

Изобретение представляет собой новую рекомбинантную плазмиду pLTB и рекомбинантный штамм Е. coli РПМВ в качестве резидентного препарата (обладающего адгезивной активностью) для защиты песцов от энтеротоксинов эшерихий.

Токсигенные энтеробактерии широко контаминируют кормовые смеси для пушных зверей, часто изолируются из паталогического материала животных. Эшерихии, например, продуцируют термолабильный, термостабильный и шига-подобный (веро) энтеротоксины, каждый из которых имеет сероварианты. Внехромосомным путем они передаются представителям других родов энтеробактерии и даже других семейств бактерий.

Самостоятельно токсины поражают кожу, гениталии, печень, органы пищеварения, выделения, а также активизируют внутриклеточных паразитов, вызывающих вирусные инфекции и паразитарные болезни животных. В результате в зверохозяйствах ежегодно регистрируют спонтанные токсикозы, выражающиеся снижением воспроизводительной функции, поражением кожи, гепатитами, гепатозами, диареей и мочекаменной болезнью. У молодняка регистрируют повышенный отход, отставание в развитии, снижение качества шкурковой продукции. В хозяйствах часто формируются стационарные очаги токсикоза.

Борьба с токсикозами данной этиологии затруднена из-за отсутствия в производстве специфических средств лечения и профилактики. Разработка специфических средств сдерживается антигенной многовариантностью энтеротоксинов разных типов.

Целью изобретения является получение нового штамма, обладающего резидентными свойствами и более широким спектром антитоксической и протективной активности.

Полученный штамм бактерий Escherichia coli РНМВ депонирован в коллекции штаммов-возбудителей заболеваний пушных зверей музея бактериальных и вирусных культур Научно-исследовательского института пушного звероводства и кролиководства (НИИПЗК) им. В.А.Афанасьева и имеет регистрационный символ РНМБ (резидентный норковый продуцент микроцина С-51 и В-субъединицы термолабильного энтеротоксина Escherichia coli) изобретение позволяет повысить продуктивность норок и сократить потери пушных зверей при воспроизводстве в зверохозяйствах.

С этой целью в генетический аппарат изолированной из кишечника норки Е. coli встроены гены, детерминирующие биосинтез микроцина С 51 и В-субъединиц термолабильного энтеротоксина эшерихий. Микроцин подавляет рост и развитие энтеробактерий, продуцирующих термолабильный, термостабильный и шигаподобный (веротоксин) энтеротоксины. В-субъединица экранирует рецепторы кишечника для энтеротоксина и инициирует специфический иммунитет в кишечнике, поскольку с нею ассоциированы детерминанты протективного антигена молекулы токсина. В то же время штамме влияет на нормальную микрофлору желудочно-кишечного тракта, в т.ч. фекальных стрептококков, бифидо и лактобактерий.

Следовательно, сконструирован оригинальный комплексный антитоксический и протективный препарат на резидентном для кишечника норки носителе, применение которого технологично для пушного звероводства.

Имеется огромное множество штаммов Е. coli, наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту к заявляемому штамму является штамм Е. coli М 17 (см. Патент РФ №1633817 с 12 №15/30), а также штамм бактерий Е. coli BKM СК-322Д (патент РФ №1819428 с 12 №15/30), обладающие антибактериальной активностью.

Сущность изобретения: получена рекомбинантная плазмидная ДНК pLTB, в которую встроены гены В-субъединицы термолабильного энтеротоксина эшерихий, и рекомбинантный штамм Е. coli РНМВ, несущий плазмид pLTB и р74 детерминирующей синтез микроцина С 51.

Однако указанные штаммы не обладают адгезивными свойствами, выделены из организма человека и неспособны к длительной персистенции в организме плотоядных.

Для получения нового штамма бактерий Е. coli РНМВ выделили фекалий клинически здоровой норки штамм бактерий Е. coli, используемый в дальнейшем для конструирования рекомбинантной, резидентной бактерии Е. coli (РНМВ) для защиты норок от энтеротоксинов кишечных бактерий.

Пример 1. Выделение резидентного штамма Е. coli.

Штамм Е. coli №4 был выделен из фекалий клинически здоровой норки. Видовая принадлежность определена на основании результатов АР- теста. Штамм не содержал плазмидной ДНК, не нес детерминант лекарственной устойчивости но обладал ярко выраженными адгезивными свойствами.

Пример 2. Получение новой плазмидной ДНК pLTB плазмиды pLTB.

Рекомбинантная плазмида pLTB получена на основе плазмиды pLT 701, несущей в своем составе полноразмерный elt-оперон.

Для этого из штамма Е. coli JM 103, несущего плазмиду pLT 701, была выделена и очищена плазмидная ДНК. Выделение и очистку проводили следующим образом. Бактериальные клетки из 10 мл ночной бульонной культуры осаждали центрифугированием и ресуспендировали в 0,5 мл буфера STET следующего состава: сахароза 8%, тритон Х-100 - 0,5%, ЭДТА 25 млм, Трис-HCl 25 мМ рН 8,0. После этого к ним добавляли 0,25 мл 0,3 м NaOH, помещали на водяную баню при температуре 70°С и инкубировали в течение 15 минут. Затем к образцу добавляли 0,2 мл смеси равных объемов фенола с хлороформом и после энергичного перемешивания центрифугировали при 14 тыс. об. в минуту в течение 10 минут. Отбирали водную фазу, к которой последовательно добавляли 0,07 мл ЗМ раствора ацетата натрия и 0,7 мл изопропанола, перемешивали и центрифугировали. Осадок ДНК дважды промывали 70% этанолом, подсушивали под вакуумом и растворяли в 0,05 мл бидистиллированной воды.

Полученный таким образом препарат плазмиды pLT701 подвергали двойному перевару посредством рестриктазы EcoRI и Pst I. Реакцию проводили в буфере, содержащем 10 мМ Трис- HCl (рН 8,5 при 37°С), 10 мМ MgCl₂, 100 мМ KCl при температуре 37°С в течение 1 часа. Реакцию останавливали прогреванием (15 мин при 65°С) и образовавшуюся смесь рестрикционных фрагментов обрабатывали ДНК-лигазой бактериофага Т4. Реакцию вели при 4°С в течение ночи.

Полученной лигазной смесью трансформировали клетки лабораторного штамма Е. coli ДН5α. Трансформацию осуществляли следующим образом: ночную культуру реципиентного штамма разводили в 100 раз средой LB и выращивали до середины логарифмической фазы роста. Клетки в объеме 40 мл осаждали центрифугированием и промывали 0,15 м NaCl, суспендировали в 2 мл 50 мМ раствора CaCl₂. После 20 минут инкубации к ним добавляли 20 мкл лигазной смеси и инкубировали еще 40 минут в ледяной бане. После температурного шока (42°, 3 мин) клетки разводили в 0,5 мл среды LB, инкубировали 1,5 часа при 37°С и высевали на агаризованную среду LB. Чашки Петри с агаризованной средой помещали на сутки в термостат при температуре 37°С. Выросшие колонии отбирали и из них выделяли плазмидную ДНК согласно описанной выше процедуре. Выделенную ДНК обрабатывали рестриктазами EcoRI и Hind III, после чего анализировали посредством электорофореза в агарозном геле. В результате были отобраны клоны, несущие помимо векторной ДНК, вставку размером 0,6 тыс. пар нуклеотидов, соответствующую гену рецепторной субъединицы В.

Пример 3. Изучение иммунологической активности В-субъединицы.

Для определения иммунологической активности белка был применен метод двойной радиальной диффузии по методу Ухтерлони.

Для этого штамм ДН5α, содержащий плазмиду pLTB, культивировали в 250 мл среды МПБ в течение 24 часов, бактериальные клетки осаждали центрифугированием, ресуспендировали в 0,01 М Трис-HCl буфера, содержащем 0,15 м NaCl с рН 8,6. Полученную клеточную суспензию подвергали обработке ультразвуком на ультразвуковом дезинтеграторе ME 150.

Для постановки реакции использовали 1%-ный агар, приготовленный на вышеуказанном буфере, и поликлональную сыворотку к полноразмерной молекуле LT.

Полученный лизат образовывал полосы преципитации с сывороткой в разведении 1:128. иммуноблот, поставленный с данным лизатом, позволил определить молекулярную массу продуцируемого белка в 12,7 кД, что соответствует молекулярной массе В-субъединицы.

Пример 4. Конструирование штамма комплексного антитоксического пробиотика РНМВ.

Введение гена В-субъединицы в резидентный штамм.

Для введения применили метод трансформации с использованием хлористого рубидия. Ночную культуру резидентного штамма разводили в 200 раз средой LB и подращивали до середины логарифмической фазы роста. Отбирали аликвоту объемом 2 мл, бактериальные клетки осаждали центрифугированием и промывали 1 мл буфера I, содержащего 10 мМ MOPS, 10 мМ RbCl pH 7,0. Клетки вновь собирали центрифугированием и ресуспендировали в 1 мл буфера II следующего состава: 100 мМ MOPS, 50 мМ CaCl₂ и 10 мМ RuCl pH 7,0. После 15 минутной инкубации при 4°С клетки осаждали центрифугированием и вновь ресуспендировали в 0,2 мл буфера II, к которым последовательно добавляли 0,01 мл ДНК плазмиды pLTB и 0,003 мл диметилсульфоксида. После 30 минутной инкубации клетки подвергали температурному шоку (44°С, 45 с) и высевали на агаризованную среду LB.

На следующем этапе в резидентный штамм, несущий рекомбинантную плазмиду pLTB, аналогичным способом вводили плазмиду р 74, детерминирующую синтез микроцина С 51. После этого проводили селекцию и отбирали клоны, стабильно продуцирующие способность к продукции обоих белков.

Изучение биологических свойств штамма пробиотика РНМБ.

Апатогенность штамма изучали на лабораторных животных и пушных зверях.

С этой целью бульонную культуру испытуемого штамма в дозе 10⁹ вводили лабораторным мышам живой массой 16-20 г перорально и внутрибрюшинно. Ни в одном случае гибели животных не наблюдали. При вскрытии животных паталогических изменений в органах не обнаружено.

При пероральном введении штамма пушным зверям на модели лабораторных животных была продемонстрирована хорошая приживаемость штамма в кишечнике.

При пероральном введении 10⁹ клеток штамм из организма подопытных животных выделялся в течение 6 месяцев (срок наблюдения).

При пероральном введении препарата белым мышам (5000 м.т.), кроликам (540 млн. м.т.), соболю (50 млн. м.т.) и норкам (15 млн. м.т.) токсичность не проявлялась.

Характеристика штамма Е. coli РНМВ

Рекомбинантный резидентный норочий антитоксический препарат обладает пролангированным действием, синтезируемые им микроцины подавляют энтеробактерии, продуцирующие энтеротоксины, а синтезируемые В-субъединицы экранируют рецепторы для энтеротоксинов и возбуждают специфический иммунитет в кишечнике; резидентные свойства носителя не вызывают отторжения штамма микроэкосистемой кишечника норки, что позволяет применять его реже и в меньших дозах.

Генетические маркеры: встроены гены, детерминирующие биосинтез микроцина С51 и биосинтез В-субъединицы молекулы термолабильного энтеротоксина эшерихий. Морфологические свойства: неспорулирующие и неокапсулированные прямые, размерами 0,6×2 мкм полиморфные палочки, слабоподвижные перитрихи, лежащие изолированно и короткими цепочками. По Граму окрашиваются отрицательно.

Культуральные свойства. Е. coli РНМВ факультативный анаэроб, хорошо размножающийся на мясопептонных питательных средах с рН 7,3 при температуре 37°С. Оптимальным является культивирование микроба в жидкой среде на шейкере при 160 качаниях в минуту на протяжении 18-19 часов. В бульоне возникает равномерное помутнение, образующее муаровые волны при встряхивании и выпадающий осадок.

На МПА образует небольшие круглые слегка выпуклые колонии с гладкими краями (S-форма). На агаре Эндо образует красные с металическим оттенком колонии.

Токсичность: Е. coli РНМВ при пероральном введении белым мышам (5000 м.т.), кроликам (50 млн. м.т.), соболю (50 млн. м.т.) и норкам (15 млрд. м.т.) не проявлялась.

Антигенные свойства. Гомологичными антисыворотками (в ИФА моноканальными антителами и РДП с поликлональными антителами) выявляются антигенные детерминанты, характерные для В-субъединицы термолабильного энтеротокина эшерихий.

Гемагглютинацией эритроцитов морской свинки выявляется адгезивный антиген носителя.

Хранение штамма достигается более года при температуре 2-6°С в лиофильном состоянии, на протяжении трех месяцев на скошенном МПА с вазелиновым маслом, на протяжении двух недель в пробирках на скошенном агаре без масла.

Контроль за состоянием штамма осуществляется двояко: раз в три месяца проверяют культуральные, морфологические и биохимические свойства и перед применением в хозяйствах подтверждают специфическую активность путем тестирования микроцинопродукции на минимальной среде Адамса с использованием индикаторной культуры Е. coli В и выявления биосинтеза В-субъединицы термолабильного энтеротоксина эшерихий в иммунохимическом анализе с поликлональными антителами.

Проверку защитной эффективности препарата в реальных производственных условиях проводили в звероплемхозе «Гагаринский» Смоленской области. Препарат, заданный в кормосмесь в дозе 25 млн. м.т., выделялся из кишечника в течение четырех недель, при этом выход щенков на одну основную самку на 0,5 щенка был выше, чем в контроле, а отхода щенков не наблюдали.

В повышенных концентрациях (500-1500 млн. м.т.) препарат обладает лечебным эффектом при разовой даче.

ПАСПОРТ МИКРООРГАНИЗМА

1. Escherichia coli РНМВ (Рекомбтнантиый резидентный норочий штамм бактерий Е. coli синтезирующий микроцинтипа С 51 и В-субъединицу LT эшерихий).

2. 6 января 2001 г.

3. Обладает антигенной активностью термолабильного энтеротоксина эшерихий и адгезивными свойствами по отношению эритроцитов морской свинки.

4. Содержит гены микроциногении и биосинтеза В-субъединицы молекулы термолабильного энтеротоксина эшерихий.

5. Не патогенна.

6. Для белых мышей, кроликов, норок и соболя при пероральном применении не патогенен.

7. На среде Адамса ингибирует индикаторную Е. coli В с зоной 8 мм, с антисывороткой, гомологичной для LT, положительно реагирует в РДП.

8. Носитель выделен из кишечника норки в 1994 г., как антитоксический; рекомбинант сконструирован Козловским Ю.Е. в 1999 г.

9. Ген микроциногении изолирован из рекомбинантной Е. coli M 17, полученной из Института молекулярной биологии РАН в 1993 г.

10. Производственный.

11. Лиофилизированный, МПА под вазелиновым маслом, на скошенном агаре.

12. Культивируют в МПБ при 37°С на шейкере при 160 кач/мин 18-20 час.

13. Пересев на МПА каждые два месяца, проверка специфической активности - каждые 6 месяцев.

14. Грамнегативные палочки, красные колонии S - формы на среде Эндо, сбраживают лактозу, сорбит, маннит, арабинозу, глюкозу, не расщепляют сахарозу, образует индол.

15. 16 августа 2002 г.

16. Гомогенная культура, 10 пробирок с агаром под вазелиновым маслом.

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм получают путем встраивания в генетический аппарат изолированной из кишечника норки E.coli генов, индуцирующих биосинтез микроцина С51 и В-субъединицы термолабильного энтеротоксина эшерихий. Микроцин подавляет рост и развитие энтеробактерий, продуцирующих термолабильный, термостабильный и шигаподобный (веротоксин) энтеротоксины, В-субъединица экранирует рецепторы кишечника для энтеротоксина и инициирует специфический иммунитет в кишечнике, поскольку с ним ассоциированы детерминанты протективного антигена молекулы токсина. Штамм используют для получения лечебно-профилактических препаратов пролонгированного действия; синтезируемые им микроцины подавляют энтеротоксические энтеробактерий, а синезируемые В-субъединицы молекулы термолабильного энтеротоксина эшерихий экранируют рецепторы для энтеротоксина и возбуждают специфический иммунитет в кишечнике; резидентные свойства носителя не вызывают отторжения штамма микроэкосистемой кишечника норки, что позволяет применять препараты на его основе реже и в меньших дозах. 2 с.п. ф-лы.

1. Штамм бактерий Escherichia coli НИИПЗК №PHMB, предназначенный для защиты пушных зверей от токсикозов, вызванных энтеротоксинами кишечных бактерий.2. Лечебно-профилактический препарат защиты пушных зверей от токсикозов, вызванных энтеротоксинами кишечных бактерий, представляющий собой взвесь бактерий Escherichia coli по п.1 в среде культивирования.