Способ активации галактозооксидазы Советский патент 1992 года по МПК C12N9/04 C12N13/00 C12N1/38 

(Л

С

Использование: пищевая промышленность и медицина. Сущность изобретения: для повышения активности галактозоокси- дазы готовят растворы этого фермента в 0,05М фосфатном буферном растворе (рН 7,0), содержащем в качестве активатора эти- лендиаминтетраацетатный комплекс меди (Cu-ЭДТА) в концентрации - моль/л. В пределах данного интервала концентрации Cu-ЭДТА в растворе фермента коэффициент повышения активности последнего превышает известный в 1,5 - 2,0 раза. В присутствии Cu-ЭДТА фермент сохраняет активность при комнатной температуре в течение 2-3 сут. Предлагаемый способ позволяет повысить точность и достоверность определения галактозы в биологических жидкостях. 1 табл.

Изобретение относится к биохимии, в частности к способам активирования ферментов, и может быть использовано в пищевой промышленности и медицине.

Известно активирующее воздействие на галактозооксидазу феррицианида калия.

Известен способ активации фермента галактозооксидазы в растворе, при котором в качестве активирующих агентов используют NaJOs, KaCraO, NaJ04, (М02)б и Na2Mo04 2H20 и дополнительно и&ны меди. При этом наблюдается повышение активности фермента галактозооксидазы в растворе относительно исходной в 3 раза.

Известны способы активации галактозооксидазы в растворе, включающие введение в раствор фермента трилона Б, или смеси феррицианида калия с каталазой, или смеси фзррицианида калия с ЭДТА.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому является способ активации галак- тозооксида зы раствором хлороиридата натрия. К раствору галактозооксидазы в фосфатном буферном растворе (рН 7,0) при- бавляют раствор хлороиридата натрия (NaalrCle). Полученный раствор обладает повышенной ферментативной активностью. В интервале концентраций хлороиридата 1 моль/л в растворе активность фермента увеличивается в 30,7 - 32,1 раз. Этот коэффициент повышения активности галактозооксидазы является максимальным для известных активаторов галактозооксидазы.

Недостатком известного способа является небольшой коэффициент повышения активности галактозооксидазы.

Целью изобретения является повышение активности галактозооксидазы.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу активации галактозооксидазы, включающему введение в буферный

2 ю со ю

00

раствор фермента добавки, в качестве добавки берут этилендиаминтетраацетатный комплекс меди с концентрацией 4.10 -4-Ю 4моль/л в активируемом растворе галакто- зооксидазы.

Для реализации способа используют CuCl2 2H20 квалификации х.ц., этилендиа- минтетраацетат натрия (трилон Б), ЭДТА квалификации х .ч , галактозу квалификации х.ч. , фермент галактозооксидазы, вы- деленный из Fusarlum graminearum ИМВ-Р-1060, в качестве буферного раствора испольауют 0,05 М Na фосфатный буфер (рН 7,0);

Фермент галактозооксидаза получен по известному методу.

Активность лиофильно высушенного порошка фермента составляет 0,1 ед/мг. Активность раствора фермента регистрируют по проявляемой активности. Активность галактозооксидазы определяют в растворе галактозы с концентрацией 0,1 моль/л в 0,05 М фосфатном буферном растворе (рН 7,0). Для этого в термостатированную при 25°С ячейку с кислородным электродом Кларка помещают 5,5 мл соответствующего раствора галактозы. После термостатирова- ния прибавляют 0,5 мл раствора фермента и регистрируют на ленте самописца кинетику потребления кислорода (1 ед, активности соответствует количеству фермента, катализирующего окисление 1 мкмоль субстрата за 1 мин).

Активность фермента в присутствии солей меди (II) осуществляют следующим об- разом.

Готовят растворы галактозооксидазы в 0,05 М фосфатном буферном растворе (рН 7,0), дополнительно содержащие этилендиаминтетраацетатный (ЭДТА) комплекс меди с различными концентрациями ( - 1 моль/л). К 5,5 мл 0,1 М. раствора галактозы в термостатируемой ячейке с кислородным электродом Кларка прибавляют 0,5 мл раствора фермента с добавкой. Активность оп- ре дел я ют как и для раствора без добавок. Для характеристики эффекта повышения активности фермента с активирующими добавками в растворе по отношению к активности исходного раствора используют коэффициент повышения активности (К), который равен отношению активности фермента в активируемом растворе к исходной активности фермента в растворе.

Пример 1. В термостатированной при 25°С ячейке определяют активность галактозооксидазы в буферном растворе, который содержит 0,1 моль/л галактозы и 1- моль/л ЭДТА комплекса медиДля расчета коэффициента повышения активности параллельно определяют активность галактозооксидазы в 0,1 моль/л растворе галактозы без добавки ЭДТА комплекса меди.

Примеры 2-7. Проводят по примеру 1, но изменяют концентрацию ЭДТА комплекса меди в растворе фермента.

Пример 8. В термостатированной ячейке к 5,5 мл раствора галактозы прибавляют 0,5 мл раствора фермента с добавкой хлороиридата натрия.

Данные влияние ЭДТА комплекса меди на активность галактозооксидазы по примерам 1 - 8 приведены в таблице.

Приведенные в таблице данные показывают, что в пределах предлагаемого интервала концентрации ЭДТА комплекса меди в растворе фермента коэффициент повышения активности фермента выше, чем у известного (примеры 2 - 4). За пределами предлагаемого интервала (примеры 1, 5 и 6) цель не достигается.

Дополнительными опытами, в которых Cu-ЭДТА добавляют непосредственно в раствор галактозооксидазы обнаружен неожиданный эффект повышения стабильности раствора фермента в присутствии Си-ЭДТА. Если раствор фермента без добавки Си-ЭДТА теряет свою активность за 7 - 8 ч, то в присутствии Си-ЭДТА фермент сохраняет активность при комнатной температуре в течение 2-3 сут.

Таким образом, предлагаемый способ активирования галактозооксидазы позволяет получить высокоактивный фермент в растворе. Применение предлагаемого способа позволит повысить точность и достоверность определения галактозы в биологических жидкостях.

Формула изобретения

Способ активации галактозооксидазы введением активатора в раствор фермента в 0,05 М фосфатном буфере с рН 7,0, отличающийся тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, в качестве активатора используют этилендиаминтетраацетатный комплекс меди в концентрации 4-105 - 4 моль/л.

Хлороиридат натрия