Способ иммобилизации галактозооксидазы Советский патент 1992 года по МПК C12N11/14 

Изобретение относится к бионеорганической химии, в частности к способам иммобилизации ферментов на неорганическом носителе, и может быть использовано для определения галактозосодержащих углеводов в пищевой промышленности (молочной, сахарной, спиртовой)и медицине.

Известны различные способы иммобилизации ферментов на кремнеземах с привитыми аминоорганогруппами на поверхности, путем предварительной активации носителя солями диазония, изоцианата- ми, галоидалкилами, хлорангидридами и т.п., фотохимическим присоединением ферментов к поверхности неорганического носителя.

К недостаткам способа, включающего предварительную активацию, следует отнести его длительность и многостадийность, а также недостаточно высокую активность полученного препарата.

Известен также способ иммобилизации галактозооксидазы путем предварительной активации дисперсного кремнезема с привитыми аминопропиловыми группами при

перемешивании его с органическим раствором хлористого цианура, с последующим удалением маточного раствора, промывкой активированного носителя растворителем для удаления избытка цианура и сушкой его на водяной бане под вакуумом. Активированный носитель смешивают с буферным раствором галактозооксидазы, инкубируют, а затем удаляют буферный раствор и отмывают от несвязавшегося фермента буферным раствором.

Недостатками способа являются его сложность и многостадийность, низкая активность полученного препарата.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ иммобилизации галактозооксидазы, включающий взаимодействие дисперсного носителя - кремнезема, содержащего на поверхности частиц привитые аминопропиловые группы с галак- тозооксидазой в буферном растворе при пе- ремешивании, введение галактозы и промывку препарата для удаления несвязанного фермента при следующем соотно(Л

С

4

Ю

СА) Ю

4

шении компонентов: на 1 г носителя-кремнезема с привитыми аминопропиловыми группами 12-115 международных единиц активности фермента и 0,36-2,88 г галактозы.

Данный способ характеризуется невозможностью повышения активности фермента в получаемом препарате при иммобилизации.

Целью изобретения является повышение активности фермента.в

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу иммобилизации галакто- зооксидазы, включающему перемешивание дисперсного кремнеземсодержащего носителя с галактозооксидазой в буферном растворе и промывку препарата для удаления несвязанного фермента, в качестве кремнеземсодержащего дисперсного носителя используют пирогенный диоксид кремния, причем берут 1 г носителя на 0,1-2,5 международных единиц активности фермента, при рН буферного раствора в пределах 4,5- 9,1.

Для реализации способа использовали следующие вещества: в качестве кремнеземсодержащего носителя - пирогенный диоксид кремния С-80 с удельной поверхностью 80 м /г, с объемом пор 1,2 см /г, размером частиц 0,25-0,5 мм, изготовленный на Ставропольском заводе химреактивов и люминофоров; галактозооксидаза из Fusarium graminearum ИМВ-Р-1060. Фермент галактозооксидаза получен по известному методу. Активность лиофильно высушенного порошка фермента составила 0,1 ед/мг, так как стабильность растворимых препаратов значительно зависит от степени очистки фермента, активность иммобилизованного препарата регистрировали по проявляемой иммобилизованным ферментом активности. В качестве буфера использовали 0,05 М Na - ацетатный буфер - рН 4,0-5,5; 0,05 М Na - фосфатный буфер - рН 5,5-8,0; 0,05 М трис-HCI - рН 8,2-9,1.

Активность иммобилизованной галак- тозооксидазы определяли следующим образом.

В термостатированную при 25°С ячейку с кислородным электродом Кларка, содержащую 5,5 мл 100 мм раствора галактозы со 100 мкм феррицианида калия и 1 М Na - ЭДТА в 0,05 М фосфатном буфере рН 7,0, вносили 0,01 г иммобилизованного фермента и регистрировали на тенте самописца кинетику потребления кислорода (1 ед. активности соответствует количеству фермента, катализирующего окисление 1 мкМ субстрата за 1 мин). Использовали коэффициент повышения активности фермента (К),

который равен отношению активности полученного препарата фермента к активности исходного буферного раствора фермента. Способ осуществляли следующим образом.

Предварительно готовили буферный раствор фермента с требуемым значением рН, затем смешивали раствор с носителем. На 1 г носителя брали 10 мл раствора с

0 ферментативной активностью. Смесь инкубировали при 25°С 2 ч и затем отмывали от несвязавшегося фермента буфером. При этом на 1 г носителя использовали 10 мл буферного раствора фермента.

5 Пример1.1г исходного пирогенного кремнезема инкубировали с 10 мл буферного раствора галактозооксидазы, содержащего 1,3 единиц активности, 2 ч. Декантацией раствор удаляли, а после этого

0 носитель отмывали от несвязавшегося фермента небольшим количеством 0,05 М фосфатного буфера (рН 7,0). Активность иммобилизованной галактозооксидазы определяли, как описано выше. Активность

5 полученного иммобилизованного препарата составляла 28,6 ед/г носителя.

Примеры 2-5. Поступали так, как описано в примере 1, за исключением того, что изменяли соотношение количества фер0 мента в растворе на 1 г носителя. Полученные результаты приведены в примерах 2-5 таблицы.

Примеры 6-13. Одинаковую во всех примерах навеску фермента 0,015 г рас5 творяли в 15 мл буферного раствора с соответствующим значением рН. К 10 мл приготовленного раствора фермента добавляли 1 г дисперсного пирогенного кремнезема. Из оставшегося раствора фермента

0 отбирали по 0,5 мл для определения исходной активности фермента. Выделение иммобилизованного фермента осуществляли так, как описано в примере 1. Полученные результаты приведены в примерах 6-13 таб5 лицы.

П р и м е р 14 (прототип). В примере приведены соответствующие данные по прототипу. В примерах 1-5 показано влияние на достижение цели соотношения ак0 тивности фермента в растворе к массе носителя-кремнезема. Если значение соотношения в предлагаемых пределах (примеры 1-3), то поставленная цель достигается. За пределами предлагаемого значения кон5 центраций (примеры 4 и 5) цель не достигается, значение К не лучше, чем у прототипа. В примерах 6-13 показано влияние рН буферного раствора на достижение цели. Если значение рН в предлагаемых пределах (при- меры 6-11), то поставленная цель достигается. За пределами предлагаемого интервала рН (примеры 12 и 13) цель не достигается, происходит инактивация фермента.

П р и м е р 14. В таблице приведены данные по способу-прототипу - зависимость активности сорбированного на модифицированном носителе фермента от концентрации растворимой галактозоокси- дазы при рН 7,0.

Таким образом, предлагаемый способ иммобилизации галактозооксидазы позволяет получить высокоактивный препарат иммобилизованного фермента, более того, полученный иммобилизованный препарат обладает активностью, значительно превышающей активность исходного раствора фермента. Используемый для иммобилизации носитель не требует предварительной

активации, что упрощает технологический процесс.

Формула изобретения Способ иммобилизации галактозооксидазы, предусматривающий смешивание дисперсного кремнеземсодержащего носителя с раствором галактозооксидазы в буфере, инкубирование смеси, декантацию раствора и отмывание препарата буфером

для удаления несвязавшегося фермента, о т- личающийся тем, что, с целью повышения активности целевого продукта и упрощения способа, в качестве дисперсного кремнеземсодержащего носителя используют дисперсный пирогенный кремнезем в количестве 1 г на 0,1-2,5 Е фермента, а для приготовления смеси применяют буферный растворе рН 4,5-9,1.

Использование: биознеорганическая химия, способы иммобилизации ферментов на неорганическом.носителе для пищевой промышленности. Сущность изобретения: 1 г дисперсного пирогенного кремнезема смешивают с 0,1-2,5 Е галактозооксидазы в буферном растворе с рН 4,5-9,1, смесь инкубируют, раствор декантируют. Препарат отмывают буфером от несвязавшегося фермента. Активность препарата 28,6 Е/г. 1 табл.

Концентрация галактозы 2,88 г/г носителя.