Способ стабилизации уреазы в растворе Советский патент 1987 года по МПК C12N9/96 

1

Изобретение относится к способам стабилизации ферментов, содержащих SH- группы, а именно к способу получения стабилизированной ураазы, которая находит применение при определении мочевины.

Фермент уреаза нестабилен при длительном хранении в холодильнике или комнатной температуре. Хранение уреа зы в растворенном виде приводит к быстрой потере активности фермента, что снижает возможность его использования для анализа мочевины в биологических жидкостях,

Цель изобретения - упрощение и удешевление способа, а также удлинение срока сохранения активности фермента.

Способ осуществляют следующим образом.

, К раствору предварительно обработанной сефадексом уреазы в фосфатном буфере в качестве стабилизатора помимо1 мм этилендиаминтетрауксус- ной кислоты (ЭДТА) добавляют сульфит натрия в количестве 10-100 мМ, Величина- рН раствора 6,8. Она является оптимальной для активности уреазы и поддерживается 0,01-0,06 М натрий- фосфатным буфером.

Эффект стабилизации в присутствии сульфита натрия обусловлен тем, что он восстанавливает частично окисленные rtpH хранении SH-группы уреазы. Сульфит натрия не может быть заменен каким-либо другим анионом по той причине, что сульфит вступает в реакцию расщепления S-S связи (в данном случае смешанного дисульфида бел ка и меркаптоэтанола) с освобождением SH-группы. Внутренние S-S связи белк имеют низкую реакционную способность по отношению к сульфиту из-за стери- ческих помех. Влиянием стерических факторов объясняется предпочтительна атака сульфит-иона на одном из атомо серы в несимметричных дисульфидах.

Реакцию восстановления дисульфид- ной связи осуществляют и другие реагенты: гидрид-ионы, арсенит, цианид, тиосульфат и др. Однако сульфит является более реакционноспособным, чем тиосульфат, и неядовит в отличие от цианида, арсената и др. Гидрид-ион может разрушить и внутренние S-S связи вследствие высокой реакционноспо- собности.

0

5

6953

2

Другое использованное свойство сульфита - способность удалять из раствора фермента кислород.

Фермент уреаза является белком с четвертичной структурой, поэтому стабильность в некоторой мере зависит от ионной силы буфера. Известно, что при концентрации фосфата натрия в буфере 0,01 М активность уреазы составляла 14 ед/мг (63%), а при концентрации 0,06 М - 22 ед/мг. При увеличении концентрации фосфата выше 0,1 М активность несколько уменьшается и составляет 80-90%.

Стабилизирующее действие этилен- диаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) объясняется тем, что она связывает ионы металлов, являющихся катализаторами окисления, молекулярным кислородом важных для активности фермента тиоловых групп.

Предварительная обработка уреазы сефадексом согласно известному способу обеспечивает обессоливание фермента и удаление неподдающихся стабилизации примесей, вследствие чего по1зышается начальная активность подвергаемой стабилизации уреазы (от активности продажной уреазы 30-50 до 90 и более Е/мг), а также ее стабильность.

Предлагаемый способ стабилизации уреазы, являющийся более прость№1 по своей технологии осуществления И бо- 5 лее дешевым по используемым в качестве стабилизаторов веществам, позволяет удлинить сроки сохранения уре- азной активности в растворе при 25 С.

0

5

0

Пример 1. 100мг продажной уреазы растворяют а 3,5 мл 60 мМ фосфатного буфера, рН 6,8, фильтруют через колонку, заполненную 150 мл геля сефадекса fj 200, предварительно уравновешенного фосфатным буфером рН 6,8, содержащим 1 мМ ЭДТА и 1 мМ меркаптоэтанола (МЭ), Элюируют тем же буфером. Активную фракцию подвергают стабилизации и испытанию на стабильность при хранении при 25°С. Контрольный образец (1 мл очищенной уреазы,концентрация которой 0,2 мг/мл) разбавляют 9мл фосфатного буфера ,8. Для стабилизации берут 1 мл pevCT- вора очищенной уреазы (концентрация 0,2 мг/мл, удельная активность 90,1 Е/мг), к нему прибавляют 9 мл фосфатного буферного раствора (60 мМ, рН 6,8), содержащего 1 мМ ЭДТА и.от 1

до 100 мМ сульфита натрия, и раствор оставляют в термостате при 25 С. Периодически измеряют активность уре азы, отбирая по 0,1 мл раствора.

Концентрация

NajSO,, мМ 01

Уреазная 4 сут 62 65 активность после хране- кия 120 сут 4,3 при 25°С, %

Наибольший стабилизирующий эффект дает применение сульфита натрия в интервале концентраций от 10 до 100 мМ: на 4-е сут хранения активность уреазы почти не меняется, после 4-месячного хранения остаточная активность составляет 33-43%. В то же время конт- рольный образец после 4 сут теряет 38% начальной активности, а после 4 месяцев она составляет только 4,3%. Время полужизни препарата, содержащего сульфит натрия в концентрации 30 мМ и сохраняющего 43% уреазной активности после 4-месячного хранения при 25 С, составляет 96 сут. Дальнейшее увеличение концентрации стабилизатора приводит к подщелачиванию среды и, следовательно, к снижению уреазной активности из-за несоответст- :

, ВИЯ рН раствора рН-оптимуму фермента.

1 Вода

2 30 мМ ,

30 мМ 1 мМ ЭДТА 100 1 мМ МЭ 1 мМ ЭДТА 100

30 мМ 1 мМ ЭДТА 100 60 мМ Na-P буф. рН 6,8

Глутатион, тринатрий цитрат, ЭДТА, уреаза (1:1:1:1), вес.ч., Н„0 100

Из таблицы видно, что при добай- лении стабилизирующих компонентов

Зависимость уреазной активности (в % от начальной) от концентрации сульфита натрия при хранении приве- дена ниже.

20

30

50

100

90

89 100

99

92

32,9

43

40

Пример 2. 100мг сухой уреазы очищают на колонке с сефадексом С 200 аналогично примеру 1. К 0,5 мл очищенной уреазы (концентрация О, 15 мг/мл, уд. активность 70,1 Е/мг) приливают воды до 10 мл (раствор 1 - контрольный препарат).

Аналогично готовят ферментные препараты в растворах 2-5, в которых содержатся различные стабилизаторы. Стабилизированный состав по прототипу растворяют в воде (препарат 6). Все образцы подвергают испытанию на стабильность при хранении втермостате при .

с

Состав растворов, время хранения

и уреазная активность в % от начальной приведены в таблице.

35,9 29,54,081,89О

100 10037,435,720,8

100 10083,358,241,7

18,8 14,411,723,220

100 85,276,574,164,2

42,727,726,630

I

начальная активность фермента не

изменяется. Препарат 5, в составе ко

торого содержится сульфит натрия и ЭДТА в натрий-фосфатном буфере, рН 6,8, теряет 50% начальной активности при 25 С в течение 82 сут. Ферментные препараты в составах 2 и 3, содержащих соответственно только сульфит натрия в воде или сульфит натрия и ЭДТА в воде, являются менее стабильньши по сравнению с ферментным препаратом в составе 5. При отсутствии сульфита натрия (раствор 4) стабилизирующий эффект еще меньше. Контрольный образец уреазы, растворенной в дистиллированной воде (состав 1), теряет половину активности менее чем за 12 ч.

Таким образом, стабильность уреазы в растворе 5, приготовленном согласно изобретению, превышает ее ста бильность в растворах, содержащих отдельные компоненты. Она также в 2 раза превышает стабильность состава по прототипу в водном растворе (препарат 6).

Стабилизированную предложенным способом уреазу использовали для приготовления ферментной уреазной мембраны, применяемой при определении мочевины,

П р и м е р 3, Приготавливают 3 образца уреазных мембран по известной методике, Уреазу предвари- тель но очищают на колонке с сефадек- (как указано в примере 1), затем смешивают ее с раствором бычьего сывороточного альбумина в фосфатном буфере следующим образом:

Образец 1: 100 мг альбумина;

0,7 мг (0,2 мл) уреазы 1,0 мл (10 мМ Na-фос- фатного буфера рН 7,0-7,2. .

Составитель Е,Воробьева Редактор М,Бандура Техред В,Кадар Корректор А,Зимокосов

Заказ 1498/24 Тираж 500Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.,, д. 4/5

.Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная, 4

10

15

25

30

20 ;

069536

Образец 2: 100 мг альбумина;

0,7 мг (0,2 мл) уреазы;

1,0 мл 10 мМ Na-фосфатного буфера рН7,0-7,2;

1 мМ меркаптоэтанола

и 1 мМ ЭДТА, Образец 3; 100 мг альбумина;

0,7 мг (0,2) уреазы;

IjO мл 10 мМ Na-фосфатного буфера рН 7,0-7,2;

30 мМ Na SOj и 1 мМ

ЭДТА,

В каждую из трех смесей добавляют по 0,03 мл 25% глутарового альдегида. Полученную смесь вьшивают -на стеклянные пластинки размером 6x6- см и оставляют для иммобилизации в холодильнике при +4 С в течение 5 ч, после чего готовые мембраны промывают водой и хранят в холодильнике каждую мембрану в буферном растворе с соответствующими добавками. После 4-месячного хранения при проверяют уреазную активность: мембрана 3 сохранила 96% начальной уреазной активности; мем:брана 1 - 42%, а мембрана 2 - 32% начальной активности. Формула изобретения

Способ стабилизации уреазы в растворе путем добавления к исходному ферменту, предварительно обработанному сефадексом, в качестве стабилизатора этилендиаминтетрауксусной кислоты при соотношении фермента и ЭДТА 1:(1-3), о.тличающийся тем, что, с целью упрощения и удешевления способа, а также удлинения срока сохранения активности фермента, исходньм фермент помещают в 0,01- 0,06 М натрий-фосфатный буфер, а в полученный раствор в качестве стабилизатора дополнительно вводят сульфит натрия в количестве 10-100 .

35

Изобретение относится к способам стабилизации ферментов, содержащих SH-группы, а именно к способу стабилизации уреазы в растворе. Цель изобретения - упрощение и удешевление способа, а также удлинение срока сохранения активности фермента. Сущ- нос.ть изобретения заключается в том, то после обработки сефадексом к раствору уреазы в 0,01-0,06 М натрийфос- фатном буфере добавляют в качестве стабилизатора зтилендиаминтетрауксус- ную кислоту (ЭДТА) при соотношении 1:1-3 и дополнительно - сульфит натрия в количестве 10-100 мМ. Способ прост по технологии и позволяет удлинить срок хранения фермента в растворе при 23 С. 1 табл. а €