Способ получения иммобилизованной галактозооксидазы Советский патент 1989 года по МПК C12N11/14 C12N11/00 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам иммобилизации ферментов на неорганическом носителе, и может быть использовано для определения галактозрсодержащих углеводов в пищевой промьшшенности (молочной, сахарной, спиртовой) и медицине.

. Цель изобретения - упрощение способа и увеличение активности иммобилизованной галактозооксидазы.

Способ заключается ь смешивании галактозооксидазы, кремнезема, содержащего аминопропиловые группы, и галактозы при соотношении компонентов: на 1 г носителя 0,9-2,88 г галактозы и 80-120 международных единиц фермента. После инкубации трех компонентов в буферном растворе в течение 2-х ч при комнатной температуре целевой продукт отмывали буфером от несвязывающегося белка. Вероятно, в этих условиях происходит превращение галактозы под действием фермента в 2,4-галактогексоди- альдозу, которая выступает в роли стк- вающего реагента и обеспечивает связыСП

ьо

«vl СП

вание фермента с аминокремнеземом. Полученные препараты обладают повышенной активностью, а сам способ значительно упрощается за счет проведения иммобилизации в одну стадию (вместо предварительной активации носителя и последующей иммобилизации), а также исключения стадии обработки хлористым циануром.

П р и м е р 1. 1 г аминоорганокрем иезема инкубируют с 50 мл буферного раствора галактозооксидазы, содержащего 46 ед. активности, и с 50 мл буферного раствора галактозы, содержащего О,.36 г галактозы. Для 1 г носителя обычно готовят 100 мл смеси. Инкубацию проводят в течение 2 ч при комнатной температуре. Количество буферного раствора не имеет существенного значения.. Декантацией раствор удаляют а после того носитель отмывают от несвязывающегося фермента небольшим количеством 0,05 М фосфатного буфе

ра (рН 7,0). Активность иммобилизован

ной галактозооксидазы определяют , как описано ниже. Активность полученного иммобилизованного препарата составляет 9 ед/г носителя.

Прим еры 2- 13. Все опрера- ции проводят в соответствии с предла гаемым способом дашобилизации галактозооксидазы при соотношения компонентов, указанных, в таблице.

.Из данных, приведенных в таблице,. видно, что активность иммобилизованно го препарата зависит от соотношения взятых компонентов. В результате взаимодействия носителя, галактозооксидазы и субстрата (галактозы), образуется иммобилизованный фермент, так как активность иммобилизованного фермента сохраняется в течение 2 мес в условиях проточного реактора (при пропускании 50 л буфера и 1000-кратного объе-

1.Способ получения иммобилизованной галактозооксидазы, включающий взаимодействие галактозооксидазы, кремнезема, содержащего на поверхности аминопропиловые группы, и вещества, инициирующего связывание фермента с кремнеземом, в буферном растворе и промывку препарата для удаления несвязывающегося фермента, о т л и ма субстрата). Стабильность препара- 45 чающийся тем, что, с целью та не отличается от стабильности фермента, иммобилизованного ковалентно известным способом. Без добавления галактозы наблюдается десорбция фермента при промывании 2 объемами 0,05N50 мом, используют продукты превращения фосфатного буфера (рН 7,0). Актив- Субстрата галактозооксидазы - галак- ность иммобилизованной галактозооксидазы определяют следующим образом. В термостатированную при 25°С ячейку с

упрощения способа и увеличения активности иммобилизованной галактозооксидазы, в качестве вещества инициирующего связывание фермента с кремнезетозы, устанавливая соотношение галактоза: кремнезем (0,9-2,88) : 1 fno массе 2. Способ по п.1, о т л и ч а ю кислородным электродом Кларка, содер- щ и и с я тем, что на 1 г кремнезема жашую 5,5 мл 100 мМ раствора галакто- добавляют 80- 115 Е фермента.

0

зы со 100 мкМ феррицианида калия и 1 мМ Na ЭДТА в 0,05 М фосфатном буфере (рН 7,0), вносят 0,01 г иммобилизованного фермента и регистрируют на ленте самописца кинетику потребления кислорода (1 ед.активности соответствует количеству фермента, катализирующего окисление 1 мкмоль субстрата за 1 мин).

Анализ данных, приведенных в таблице,, показывает, что повышение активности наблюдается при добавлении 0,9-2,88 г галактозы на 1 г носителя. 11овьш1ение концентрации галактозы до 3,24 г не приводит к увеличению активности целевого продукта, а снижение концентрации галактозы до 0,18 и 0,36 г вызывает уменьшение активности фермента. Увеличение активности иммобилизованной галактозооксидазы наблюдается при указанной концентрации галактозы и при добавлении 80- 115 ед активности фермента на 1 г

Таким образом, предлагаемый способ позволяет упростить процесс получения иммобилизованной галактозооксидазы за счет исключения ряда стадий, а также увеличить активность це- 30 левого продукта от 59-75 до 75-89 ед. 1 г (в зависимости от количества использованного фермента).

Формула изобретения

1.Способ получения иммобилизованной галактозооксидазы, включающий взаимодействие галактозооксидазы, кремнезема, содержащего на поверхности аминопропиловые группы, и вещества, инициирующего связывание фермента с кремнеземом, в буферном растворе и промывку препарата для удаления несвязывающегося фермента, о т л и чающийся тем, что, с целью мом, используют продукты превращения Субстрата галактозооксидазы - галак-

чающийся тем, что, с целью мом, используют продукты превращения Субстрата галактозооксидазы - галак-

упрощения способа и увеличения активности иммобилизованной галактозооксидазы, в качестве вещества инициирующего связывание фермента с кремнезечающийся тем, что, с целью мом, используют продукты превращения Субстрата галактозооксидазы - галак-

тозы, устанавливая соотношение галактоза: кремнезем (0,9-2,88) : 1 fno массе). 2. Способ по п.1, о т л и ч а ю Примечание. По примереам 1Д-18 иммобилизация по известному способу.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам иммобилизации ферментов на неорганических носителях, и может быть использовано для определения галактозосодержащих углеводов в пищевой промышленности и медицине. Цель изобретения - упрощение способа и увеличение активности иммобилизованной галактозооксидазы. Способ заключается в смешивании буферного раствора галактозооксидазы с кремнеземом, содержащим аминопропильные группы, в присутствии 0,9-2,88 г галактозы на 1 г носителя, при этом галактоза окисляется ферментом до 2,4-галактогексодиальдозы, которая обеспечивает сшивку фермента с носителем. Положительный эффект достигается при добавлении 80-115 ед. активности фермента на 1 г носителя. Использование способа упрощает процесс иммобилизации и увеличивает активность целевого продукта. 1 табл.