НАТРИЕВАЯ СОЛЬ β -(3-НИТРОФЕНИЛ)- b -АМИНОПРОПИОНОВОЙ КИСЛОТЫ, ОБЛАДАЮЩАЯ АНТИГЕМОРРАГИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ Советский патент 1995 года по МПК C07C229/20 A61K31/195 

Предлагается новое биологически активное химическое соединение, а именно натриевая соль β -(3-нитрофенил)-β -аминопропионовой кислоты формулы
CH₂COONa обладающеe антигеморрагическим действием: оно может быть использовано в медицине.

В литературе известны производные β-аминопропионовой кислоты, которые в основном обладают антигипертензивным действием.

Известны также N-n-толуолсульфонил- β-(n-амилоксифенил)-β-аминопропионат ε -аминокапроновой кислоты, гидрохлорид β -(4-фторфенил)- β -аминопропионовой кислоты, обладающей антигеморрагическим действием.

Аналогом по биологическому действию выбран протамина сульфат, широко применяющийся в качестве антигеморрагического средства (антагонист гепарина) при кровоточивости, вызываемой гепарином, после операции с экстракорпоральным кровообращением и применением гепарина, после окончания гемодиализа, при повышении содержания в крови эндогенного гепарина.

Целью изобретения является изыскание нового производного аминокислот, более малотоксичного и эффективного по антигеморрагическому действию.

Поставленная цель достигается натриевой солью β-(3-нитрофенил)- β -аминопропионовой кислоты, которую получают путем взаимодействия 3-нитробензальдегида с малоновой кислотой в присутствии уксуснокислого аммония с последующей обработкой полученной β-(3-нитрофенил)- β-аминопропионовой кислоты 5% -ным раствором бикарбоната натрия по схеме
HCH₂-C
Натриевая соль β-(3-нитрофенил)-β-аминопропионовой кислоты (соединение 1) представляет собой белое порошкообразное вещество без запаха, растворимое в воде, водном этаноле (1:1), диметилсульфоксиде, труднорастворимое в диметилформамиде.

П р и м е р 1. β-(3-Нитрофенил)- β-аминопропионовая кислота (II).

К 15,1 г (0,1 моль) свежеперегнанного 3-нитробензальдегида прибавляют 15,41 г (0,2 моль) уксуснокислого аммония и 11,96 г (0,115 моль) малоновой кислоты в 250 мл н-бутилового спирта. Смесь кипятят 17-18 ч, в горячем состоянии отфильтровывают образовавшиеся белые кристаллы и промывают 200 мл горячего н-бутанола, затем 100 мл горячего этанола. Полученный осадок растворяют в 80 мл 1н. раствора гидроокиси натрия, экстрагируют этилацетатом и водный слой подкисляют 1 н. раствором соляной кислоты до pH 5-6. Выпавший осадок отфильтровывают и высушивают. Выход 10,8 г (51,6%) т.пл. 240-242^оС, R_f 0,68 (пропанол-вода 7:3).

Найдено, C 51,72; H 4,79; N 13,33.

C₉H₁₀O₄N₂.

Вычислено, C 51,43; H 4,87; N 13,21.

ИК-спектр, ν см^-1: 1650 (СO карб), 1610 (аромат.), 3100-3300 (NH₂ ассоциир.).

Спектр ПМР гидрохлорида, Д₂О, δ м.д. 8,42-7,47 (4Н, м, Аг), 5,0 (1Н, с, СН), 3,57-1,74 (2Н, м, СН₂).

П р и м е р 2. Натриевая соль β -(3-нитрофенил)-β-аминопропионовой кислоты (I).

К 4,2 г (0,02 моль) β-(3-нитрофенил)-β-аминопропионовой кислоты (II), суспензированной в 20 мл дистиллированной воды, добавляют 5%-ный водный раствор бикарбоната натрия до pH 8-8,5. Реакционную смесь кипятят 10 мин, фильтруют в горячем состоянии и упаривают воду на роторном испарителе. Выход 4,21 г (91,1%), т.пл. 208-210^оС, R_f 0,74 (пропанол вода 7:3).

Найдено, C 46,88; H 4,16; N 12,36.

C₉H₉N₂O₄Na.

Вычислено, C 46,76; H 3,92; N 12,11.

ИК-спектр, ν см^-1: 1700 (СO карб.), 1600 (аромат.), 3100-3200 (NH₂).

Спектр ПМР, Д₂O, δ м.д. 8,21-7,30 (4Н, м, Аг), 4,27 (1Н, т, СН), 2,47 (2Н, д, СН₂).

Действие соединения I изучают для определения времени свертывания цельной крови. Метод основан на определении времени образования сгустка венозной крови. В качестве показателей свертываемости крови также определяют: толерантность плазмы к гепарину, тромбиновое время, время рекальцификации плазмы.

При определении толерантности плазмы к гепарину исследуют влияние определенных количеств гепарина на время рекальцификации цитратной плазмы. Определение тромбинового времени основано на выявлении времени образования сгустка плазмы при добавлении к ней избытка тромбина. Принцип метода pекальцификации плазмы основан на определении времени свертывания плазмы при добавлении к ней оптимального количества CaCl₂.

Изучено также влияние соединения I на показатели реологии кpови и проницаемость капилляров: на кроликах измеряют агрегацию эpитроцитов и тpомбоцитов спектрофотометрическим методом на аппарате "Спекол-10", коллоидно-осмотическое давление с помощью рефрактометра, проницаемость капилляров для жидкости и для белка. Животных наблюдают в исходном состоянии и после внутривенного введения соединения I и протамина сульфата, исследуют также их действие на фоне гепарина.

Опыты проводят на 150-крысах массой 120-130 г по 8-10 животных в каждой серии опытов. В опытах по определению времени свертывания цельной крови пробы крови в количестве 1 мл берут из яремной вены крыс, находящихся под легким эфирным наркозом.

При определении остальных изучаемых показателей свертываемости крови получают кровь, смешивают с 3,8-ным раствором цитрата натрия в соотношении 9: 1, центрифугируют при 1500 об/мин в течение 10 мин и далее работают с плазмой. Действие соединения I изучают в дозах 50-100 мг/кг.

Оптимальная доза исследуемых соединений 50 мг/кг. Соединение I в дозе 50 мг/кг, вводят внутрибрюшинно как отдельно, так и на фоне введения гепарина (через 30 мин после его введения). Соединение I вводят в виде 5-ного водного раствора. Контрольной группе животных вводят физиологический раствор в том же объеме, что и препарат. Гепарин вводят внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг. Время свертывания крови определяют через 40 мин после введения испытуемых соединений.

Данные обрабатывают статистически с помощью критерия Стьюдента (Р<0,05).

Острую токсичность соединения I и протамина сульфата изучают на белых мышах (18-22 г). Соединение I и протамина сульфат вводят внутрибрюшинно в различных дозах. На каждую дозу используют по шесть животных. После введения соединения через 24 ч производят подсчет погибших и оставшихся в живых мышей.

Как видно из табл.1, гепарин в дозе 10 мг/кг понижает время свертываемости крови на 95% Соединение I в зоне 50 мг/кг повышает время свертываемости на 44%
Введение соединения I на фоне предварительного введения гепарина повышает свертываемость крови на 68% протамина сульфата на 62% гидрохлорида β-(4-фторфенил)-β-аминопропионовой кислоты (соединение III) на 52% На этом же фоне определяют длительность действия соединения I и протамина сульфата.

Соединение I повышает время свертываемости крови через 80 мин, 120 мин и 6 ч (69-62% ), в то время как протамина сульфат через 80 мин действует уже гораздо слабее, а через 2 ч повышает время свертывания на 37% Соединение III повышает время свертывания через 80 мин 2 ч на 52-54% через 6 ч на 30% (см. табл.2).

Далее изучают влияние соединения I на некоторые показатели свертываемости крови, а именно тромбиновое время, толерантность плазмы к гепарину, время рекальцификации плазмы. Как видно из табл. 3 гепарин в дозе 10 мг/кг удлиняет тромбиновое время, понижает толерантность плазмы к гепарину (время свертываемости удлиняется), увеличивает время рекальцификации плазмы. Как соединение I, так и протамин сульфат на фоне гепарина оказывают одинаковое действие на тромбиновое время. Толерантность плазмы к гепарину как под влиянием соединения I, так и протамина сульфата повышается также одинаково (на 40-44% ). Время рекальцификации под влиянием соединения I укорачивается на 57% под влиянием протамина сульфата на 51%
При изучении острой токсичности выявлено, что соединение I малотоксично: LD₅₀, вычисленная по Беренсу, равна 2500±37 мг/кг, протамина сульфата 75±6,3 мг/кг, соединения III 1100±49 мг/кг. При изучении показателей реологии крови и проницаемости капилляров достоверно увеличивалась лишь агрегация тромбоцитов под влиянием соединения I.

Таким образом, натриевая соль β-(3-нитрофенил)- β-аминопропионовой кислоты, будучи растворимым веществом, обладает выраженной длительной антигеморрагической активностью, повышая свертываемость крови как на интактных, так и на гепаринизированных животных и превосходит по активности и длительности действия гидрохлорид β-(4-фторфенил)- β-аминопропионовой кислоты и протамина сульфат.

Изобретение касается замещенных аминокислот, в частности натриевой соли b (3-нитрофенилы)- b аминопропионовой кислоты, обладающей антигеморрагическим действием, что может быть использовано в медицине. Цель создание новых более активных и малотоксичных веществ указанного класса. Синтез ведут реакцией 3 нитробензальдегида с малоновой кислотой в присутствии уксуснокислого аммония с последующей обработкой полученного продукта 5%-ным раствором бикарбоната натрия. Выход 51,6% т. пл. 240 242°С. БФ C₉H₁₀N (кислота). Ее натриевая соль получают обработкой бикарбонатом натрия до рН 8 8,5 с последующим кипячением, горячим фильтрованием и упариванием. Выход 91,1% т. пл. 208 210°С. БФ C₉H₉N₂O₄Na оптимальная доза 50 мг/кг за время свертывания 80 мин, 2 ч и 6 ч степень свертываемости повышается на 69 62% против 37% через 2 ч протамина сульфата. Новое соединение, как и протамин сульфат, оказывает одинаковое действие на тромбиновое время на фоне гепарина, толерантность плазмы повышается одинаково (на 40 44%), но время рекальсификации укорачивается на 57% против 51% 3 табл.

Натриевая соль b -(3-нитрофенил)- b -аминопропионовой кислоты формулы

обладающая антигеморрагическим действием.