СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТАМИНОВ Российский патент 1997 года по МПК A61K38/36 

Изобретение относится к медицине, в частности к химическим способам получения протаминов, которые могут быть использованы для нейтрализации гепарина после проведения экстракорпорального кровотока.

Препараты протаминов представляют собой различные соли основных ядерных белков клеточного ядра молок рыб. Коммерческие препараты протаминов представляют собой смесь индивидуальных компонентов и белков непротаминовой природы.

Известен способ получения протаминов из гонад рыб, заключающийся в экстракции сырья водным раствором неорганических кислот, сорбции протаминов из полученного экстракта при pH 6 10 ионитом и десорбции целевого продукта раствором неорганической кислоты. Данным способом можно получить препараты, обладающие антигепариновой активностью 90 ЕД.

Известный способ не позволяет избежать деструкции протаминов и не обеспечивает получения препаратов высокой антигепариновой активности.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату является способ получения протаминов, заключающийся в очищении молок рыб от жира и соединительной ткани, гомогенизации, фильтровании, центрифугировании, промывании осадков раствором Рингера, повторной гомогенизации, воздействии ультразвуком, обработке раствора ферментом при 36 - 38^oC, времени гидролиза 1 4 ч и соотношении фермента к субстрату в пределах 1:350 1: 650 и последующем хроматографическом выделении целевого продукта. Указанным способом можно получить препараты протаминов со значением антигепариновой активности 125 ЕД.

Данный способ также не позволяет получать препараты протаминов высокой антигепариновой активности.

Целью изобретения является повышение антигепариновой активности препаратов протаминов.

Цель достигается предложенным способом, включающим очищение молок рыб от жира и соединительной ткани, гомогенизацию, фильтрование, центрифугирование, промывание осадков раствором Рингера, воздействие ультразвуком, очистку полученного продукта ионообменной хроматографией, обработку полученного раствора уксусным ангидридом при соотношении протамин: уксусный ангидрид 1:100 1:300 с последующим хроматографическим выделением целевого продукта.

Отличие предложенного способа заключается в том, что раствор, полученный после воздействия ультразвуком, очищают ионообменной хроматографией и обрабатывают уксусным ангидридом при соотношении протамин: уксусный ангидрид 1: 100 1:300.

Установлено, что после воздействия ультразвуком раствор полученного продукта содержит значительное количество примесей, существенно снижающих значение антигепариновой активности. Для очистки полученного продукта от примесей используют ионообменную хроматографию.

Молекулы протаминов образуют в растворе молекулярные ассоциаты, наличие которых вызывает значительные стерические затруднения при взаимодействии протаминов с гепарином, снижая тем самым антигепариновую активность препаратов протаминов. Нами установлено6 что обработка протаминов уксусным ангидридом ведет к снижению количества молекулярных ассоциатов протаминов в растворе, что облегчает взаимодействие молекул протаминов с молекулами гепарина и увеличивает посредством этого значение антигепариновой активности препаратов протаминов.

Обработка раствора протамина уксусным ангидридом при соотношении протамин: уксусный ангидрид ниже 1:100 и выше 1:300 ведет к снижению антигепариновой активности препаратов протаминов по сравнению с прототипом (см. чертеж).

Предлагаемым способом получены препараты протаминов и экспериментально проверена их антигепариновая активность.

Пример 1. Гонады Acipenser Stellatus очищают от жира и соединительной ткани, 5 г полученного материала гомогенизируют в 30 мл раствора Рингера и фильтруют через хлопковую ткань. Осадок промывают раствором Рингера и центрифугируют при 8000 об/мин в течение 10 мин. На водный раствор 200 мг полученного нуклеопротамина /сухой вес/ действуют ультразвуком /прибор УЗД-1 с силой тока 0,4 А и рабочей частотой 22 кГц 2 мин и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 20 мин. Раствор доводят до pH 4,4 NaOH и наносят на колонку с ионообменником Амберлит ЦГ-50 /1,5х5,0 см/, уравновешенную 0,05 М натрий-ацетатным буфером /pH 4,6/. Колонку промывают последовательно исходным раствором буфера, 0,2 М раствором уксусной кислоты и водой. Протамины элюируют 0,1 н. раствором соляной кислоты и pH быстро доводят до 5 6 с помощью анионообменника Амберлит 1 ИРА-400 в OH-форме. К выделенному раствору протамина добавляют 2 мл раствора бикарбоната натрия /1 мг/мл/ и по истечении 30 с добавляют 1 мл свежеперегнанного уксусного ангидрида в метаноле /1:3/ в соотношении протамин: уксусный ангидрид 1:100. По окончании ацетилирования целевой продукт очищают с помощью ионообменной хроматографии, как описано выше. Выделенный целевой продукт лиофилизуют и определяют его антигепариновую активность.

В экспериментах m vitro антигепариновую активность полученных соединений оценивали по их способности ингибировать метахроматический эффект гепарина с 0,02% водным раствором толуидинового синего.

Оптимальные нейтрализующие антикоагулянтную активность гепарина весовые соотношения протаминов определялись методом титрования антикоагулянта его антагонистами по времени рекальцификации плазмы и цельной крови на коагулометре "Schnitger-Gross".

Антигепариновый эффект in vivo исследовали на кроликах массой 2 3 кг, которым в краевую вену уха вводили 5 мг/кг гепарина /"Рихтер"/. Через 10 мин его нейтрализовали внутривенным введением одного из препаратов протаминов, исходя из предварительно полученных весовых соотношений. Кровь отбирали из краевой вены другого уха в 3,8% цитрат натрия /9:1/ до введения препаратов, через 5 мин после введения гепарина и через 5, 15, 30, 60 мин после введения гепарина и через 5, 15, 30, 60 мин после его нейтрализации. Свертываемость образцов крови тестировалась по времени рекальцификации, толерантности крови к гепарину, тромбопластиновому времени по Квику, записывалась тромбоэластограмма на приборе "Hellige" /ФРГ/.

Количество протаминов определяли по реакции Сакагуши. Антигепариновая активность полученного соединения 160 ЕД.

Пример 2. Осуществляют то же, что и в примере 1, при этом соотношение протамин: уксусный ангидрид 1:200. Антигепариновая активность полученного соединения 176 ЕД.

Пример 3. Осуществляют то же, что и в примере 1, при этом соотношение протамин: уксусный ангидрид 1:300. Антигепариновая активность полученного соединения 145 ЕД.

Из приведенных примеров видно, что наиболее высоким значением антигепариновой активности в ряду полученных соединений обладает препарат, полученный при соотношении протамин: уксусный ангидрид 1:200, антигепариновая активность составляет 176 ЕД (пример 2). Препарат протамина (прототип) имеет значение антигепариновой активности 125 ЕД.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет увеличить значение антигепариновой активности препаратов протаминов в 1,4 раза6 что ведет к снижению расхода лекарственного препарата, и использовать для этого более дешевые и доступные реагенты.

Изобретение относится к медицине, в частности к химическим способам получения протаминов, которые могут быть использованы для нейтрализации гепарина после проведения экстракорпорального кровотока. Целью изобретения является повышение антигепариновой активности препаратов протаминов. Это достигается тем, что способ включает в себя очищение молок рыб от жира и соединительной ткани, гомогенизацию, фильтрование, центрифугирование, промывание осадков раствором Рингера, воздействие ультразвуком, и, согласно изобретению, раствор, полученный после воздействия ультразвуком, очищают ионообменной хроматографией, обрабатывают уксусным ангидридом при соотношении протамин: уксусный ангидрид 1:100-1:300 с последующим хроматографическим выделением целевого продукта. 1 ил.

Способ получения протаминов, включающий очищение молок рыб от жира и соединительной ткани, гомогенизацию, фильтрование, центрифугирование, промывание осадка раствором Рингера, обработку раствора ультразвуком с последующим хроматографическим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения антигепариновой активности, раствор после воздействия ультразвуком очищают ионообменной хроматографией и обрабатывают уксусным ангидридом при соотношении протамин уксусный ангидрид 1 100 300.