Способ получения антирабического иммуноглобулина Советский патент 1992 года по МПК A61K39/205 G01N33/531 

Изобретение относится ,; области медицины, а именно к производствен ной трансфу- зиологии, и предназначено для получения высокоэффективного, длительно сохраняющегося антирабического иммуноглобулина для профилактики и лечения гидрофобии.

Известны способы получения иммуноглобулинов направленного действия; антистафилококкового, противогриппозного, противостолбнячного, противосинегнойно- го и др. Известны также способы получения антирабического иммуноглобулина. В основе этих способов лежит иммунизация соответствующими антигенами и выделение иммуноглобулина из плазмы крови.

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является способ получения антирабического иммуноглобулина человека, который предусматривает внутримышечное введение донорам концентрированной культуральнэй антирабической вакцины (КОКАВ) из вирусного

штамма Внуково 32-107, в дозе 1,5 мл на 1, 30, 90 сут. Способ позволяет получить алло- генный антирабический иммуноглобулин с титром вируснейтрализующих антител 1:2430-1:7290.

Однако техническое решение имеет следующие недостатки: длительность интервалов между введениями вакцины, практически неприемлемая для донорства, большой разброс титров вируснейтрализующих антител (ВНАТ) в сыворотке крови вакцинируемых, в связи с отсутствием целенаправленного подбора контингента доноров, что в свою очередь приводит к получению препарата с нестандартным диапазоном титров в различных сериях; получение препарата в жидкой лекарственной форме (в виде 10% раствора), что сокращает срок его хранения, создает неудобство при транспортировке в очаги эпизоотии.

Целью изобретения является повышение специфической активности, стабильносл

с

-ч

сл ю сл XI

сти и удлинение сроков хранения аллоген- ного антирабического иммуноглобулина для внутримышечного введения.

Поставленная цель достигается целенаправленным подбором доноров для иммунизации КОКАВ, относящихся к 0(1), А(П) группам крови по системе АВО, специально отработанной схемой иммунизации, выделением у-глобулиновой фракции из плазмы крови с последующей ее очисткой методом диафильтрации на плоскорамных фильтрах, заправленных полиамидными мембранами на подложке типа УПМ II, и лиофилизацией препарата на конечном этапе.

Отличительными признаками изобретения являются подбор доноров 0(1) и А(И) групп крови для иммунизации, высокореагирующих на введение антирабической вакцины, результаты наблюдений свидетельствуют о значительно более низком уровне специфического иммунного ответа доноров В (111) и АВ (IV) групп крови; отбор плазмы крови доноров с высоким содержанием вируснейтрализующих антител. Титр В HAT определяется в параллельных исследованиях реакции нейтрализации на белых беспородных мышах и в иммуноэнзимати- ческом тесте; очистка у -глобулиновой фракции методом диафильтрации на плоскорамных фильтрах с полиамидными мембранами на подложке типа УПМ-Н.

Совокупность отличительных признаков дала возможность разработать способ получения аллогенного антирабического иммуноглобулина в лиофилизированном виде с высоким титром В HAT.

Сущность изобретения характеризуется конкретными примерами исполнения.

П р и м е р 1. Донор И. Группа крови О (I). Введение концентрированной культураль- ной антирабической вакцины в количестве 1,0 мл проводят с соблюдением строгих правил асептики и антисептики в верхний наружный квадрант ягодицы на 0, 7,15, 30 сут. На 45 сут в сыворотке крови донора определяют титр ВНАТ в реакции нейтрализации на белых беспородных мышах и в иммуноэнзи- матическом тесте. Результат определения: 1:810. Плазму крови, изъятую методом плаз- мафореза фракционируют спиртовым способом в соответствии с действующим регламентом производства 10-16% раствора гамма-глобулина из донорской плазмы,

Фракционирование иммунной антирабической донорской плазмы проводили по методу Кона в соответствии с регламентом производства раствора гамма-глобулина из донорской плазмы. Для этого осадок белков

фракции II+III, содержащий гамма-глобули- новую фракцию, выделяют в соответствии с регламентом производства 5, 10 и 20% альбумина.

Затем проводят переосаждение белков

фракции II+III. Осадок фракции II+III, хранившийся не более трех месяцев при температуре не выше -20°С, растворяют в предварительно охлажденном до 0° физио0 логическом растворе из расчета 7,5 объемов физиологического раствора по отношению к весу осадка, Суспензию загружают в стеклянный сосуд, помещенный в фракционный стол, при температуре спирта большой ван5 ны-1 ±1,0С. Суспензию.при постоянном помешивании охлаждают до Ои и перемешивают при этой температуре еще два часа. Затем температуру спирта большой ванны фракционного стола понижают до (-5) -(-6)°С. Су:

0 пензию охлаждают до температуры -1°С. В мерник медленно заливают предварительно охлажденный до -15 - -20°С 95% этиловый спирт в количестве 240 мл на 1 л суспензии. Конечная концентрация спирта

5 в смеси 19%.

Смесь перемешивают не менее двух часов при температуре (-5) - (-6)°С (созревание осадка). Затем осадок отделяют центрифугированием в стаканчиковых ре0 фрижераторных центрифугах при температуре (-5) - (-6)°С и 2700-3000 об/мин в течение 30 мин. Осадок собирают в закрытую емкость и взвешиваюг,хранят при температуре (-35) - (-50)°С не более одного

5 месяца.

Получение осадка гамма-глобулина. Центрифугат загружают в стеклянный сосуд, помещенный во фракционный стол при температуре спирта большой ванны (-5)

0 - (-6)°С. К раствору добавляют 5 М раствор хлористого натрия из расчета 10 мл на каждый литр центрифугата, устанавливают рН 7,0-7,2 путем добавления 4,2 % раствора бикарбоната натрия. Затем из мерника добав5 ляют охлажденный до температуры (-15) - (-20)°С 95% этиловый спирт из расчета 160 мл на 1 литр смеси. Конечная концентрация спирта в смеси 26%. Затем смесь перемешивают не менее двух часов, центрифугиру0 ют при температуре (-5) - (-б)°С, 2700-3000 об/мин в течение 30 мин и выделяют фракцию II (осадок В).

Выделенную фракцию II (осадок В) суспендируют в охлажденном 0,9% растворе по5 варенной соли в соотношении вес/объем f :2. Концентрация белка в суспензии составляет 5,0-5,5%. Смесь оставляют на длительное время (до двух месяцев) для отстаивания. По истечении этого времени отстоявшуюся жидкость пропускают через мезгу, и осветленный раствор подвергают диафильтра- ции, которую проводят на плоскорамных фильтрах, заправленных полиамидными мембранами на подложке типа УПМ II.

Продолжительность очистки 10 литров 5% раствора гамма-глобулина на этой установке составляет 4 ч. Очищенный от низко- молекулярных примесей раствор пропускают через стерилизующие фильтры и разливают в ампулы для лиофилизации.

Пример 2.Донор П. Группа крови А(Н), КОКАВ вводили в дозе 1,0 мл по схеме 0, 7, 15, 30 сут. На 45 сут определяли титр В HAT. Результат определения-титр ВНАТ 1:516. Иммуноглобулин получали аналогичным способом.

ПримерЗ. Донор С., Группа крови B(lll). КОКАВ вводили в дозе 1,0 мл по схеме 0,7,15,30 сут, На 45 сут определяли титр ВНАТ. Результат определения - титр ВНАТ 1:30. Плазма не пригодна для получения ан- тирабического иммуноглобулина.

П р и м е р 4. Донор К. Группа крови АВ (IV). Проведена внутримышечная иммунизация КОКАВ в дозе 1,0 мл по схеме 0, 7, 15, 30 сут. На 45 сут определяли титр ВНАТ. Результат определения - титр ВНАТ 1:45,5. Плазма не пригодна для получения антира- бического иммуноглобулина.

Целевой продукт, полученный в лиофи- лизированном виде, характеризуется титром ВНАТ 1:54 000.

Результаты распределения уровня ВНАТ с учетом групповой принадлежности сывороток крови представлены в таблице.

Таким образом, согласно изобретению, разработан способ получения лиофилизиро- ванного аллогенного антирабического иммуноглобулина с титром вируснейтрализующих антител не менее чем 1:50 000. Сухой препарат антирабического иммуноглобулина выпускается в запаянных ампулах и представляет собой таблетку или порошок кремоват ого цвета. Предлагаемый способ позволяет получить быстрорастворимый антирабический иммуноглобулин, который хранится при 18- 22°С и не требует специальных условий при транспортировке в очаги эпизоотии, не подвергается фрагментации в процессе хранения, безвреден для организма и пригоден для внутримышечного введения. Сухой иммуноглобулин термостабилен (выдерживает после растворения прогрев при57°С в течение 4 ч), не имеет остаточного спирта, что также исключает денатурацию белка при. хранении.

Воспроизведение способа доступно для производства препаратов крови в условиях заводов бакпрепаратов, станций переливания крови, производство экономически оправдано, не требует специального оборудования. Данный препарат крайне необходим для практического здравоохранения.

П р и м е р 5. Стабильность препарата. Лиофилизированный аллогенный антирабический иммуноглобулин после двух лет хранения при t 16 - 22 °С сохранял исходную специфическую активность и физико-химические свойства. Срок годности препарата определяли также при хранении препарата в течение 1 мес при температуре -37°С. Данный метод применяется для изучения стабильности иммунных препаратов различной направленности и предусматривает, что условия хранения в течение трех лет при температуре (+2)-(+10)°С равны одному году при температуре (+18)-(+22)° С и равноценны хранению в течение одного месяца при температуре +37°С.

Результаты исследований свидетельствуют о сохранении специфической активности антирабического донорского иммуноглобулина в титре 1:31180 после хранения при 37°С один месяц, что соответствует 442 ME. В то же время известно, что коммерческие препараты донорского иммуноглобулина, применяемые за рубежом с лечебной и профилактическойцелью, имеют специфическую активность 150 ME.

Таким образом, целевой продукт полностью пригоден к применению в результате двух лет хранения при t (+16)-(+22)°C и последующего хранения при t +37°C один месяц, что в общей сложности соответствует трем годам хранения при t(+16)-(+22)°C или примерно девяти годам хранения при температуре +4°С.

Формула изобретения Способ получения антмрабического иммуноглобулина путем внутримышечного введения концентрированной культураль- ной антирабической вакцины КОКАВ донорам с последующим выделением целевого продукта из плазмы крови, отличающий- с я тем, что, с целью повышения специфической активности целевого продукта, его стабильности и удлинения сроков хранения, вакцину вводят донорам 0(1) и А (II) групп крови в объеме 1,0 мл на 0, 7, 15, 30 сутки, выделенную из плазмы крови гамма-глобу- линовую фракцию отстаивают, подвергают диафильтрации на плоскорамных фильтрах, заправленных полиамидными мембранами на подложке типа и полученный целевой продукт лиофилизируют.

Р -сравнение проведено по отношению к 0(1) и А (II) группам крови.

Использование: медицина, производство иммуноглобулина. Доноров 0(1) и А(И) групп крови иммунизируют антирабической вакциной, выделяют из плазмы крови иммуноглобулин, очищают его методом диа- фильтрации на плоскорамных фильтрах, заправленных полиамидными мембранами на подложке типа УПМ-И и лиофилизуют. Полученный антирабический иммуноглобулин обладает высокоспецифической активностью и содержит вируснейтрализующие антитела в титре не менее 1 50 000. 1 табл.