Способ определения генотоксичности водорастворимых веществ Советский патент 1992 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к микробиологии, водной токсикологии и предназначено к использованию для биологического контроля за токсичными водорастворимыми веществами, а также может быть использовано для контроля сточных и природных вод и при оценке генотоксичности водорастворимых веществ при исследовании генетических основ адаптации организмов йГ изменяющимся условия окружающей среды...

Известен способ оценки теста на гёно- токсичность, использующий определение разрывов нитей ДНК в клетках лимфрмы мыши при щелочной денатурации с элю- цией через оксиапатит.

Этот известный способ затруднительно использовать для контроля сточных и природных вод вследствие необходимости введения их во внутрь организма и, кроме того, не каждый последующий токсикант приводит к разрывам ДНКГ -,

Известен способ биологической оценки токсичности водьХ согласно которому производят экспозицию рач ков-дафний в исследуемой воде и по числу погибших дафний и длительности экспозиции судят о степени токсичности исследуемой воды.

Недостатком этого способа является его невысокая чувствительность, т.к. по гибели дафний возможно оценивать только

NJ (Л СЛ

О

ь

высокие дозы токсиканта, что ограничивает область использования.

Известен также способ определения токсичности водорастворимых веществ, согласно которому инфузории Tetrahymena pyrlformis диспергируют в культуральной среде, регистрируют динамику изменения величин светопропускания культуры до и после экспозиции с исследуемым веществом и по изменению двигательной активности при воздействии исследуемого вещества различной концентрации оценивают его токсичность.

Недостатком этого способа является низкая чувствительность и недостаточность интерпретации полу внных результатов, т.к. двигательная активность инфузорий является интегральным показателем. Этим способом не обеспечивается оценка гено- токсичности, что ограничивает область использования,

Цель изобретения - повышение чувствительности и достоверности определения и расширения области использования.

Способ осуществляется следующим образом.

В суточную культуру инфузорий Tetrahymena pyriformls, растущую на пеп- тонной среде (пептон 20 г, дрожжевой экстракт 1 мл, глюкоза 5 г, NaCI - 1 г, вода дистиллированная до 1 л, рН 7,1) при 27° С и содержащую 60-80 тыс. особей в 1 мл, или 5-суточную культуру Chlorella vulgaris, культивируемую на солевой среде Успенского (КМОз 0,025 г, MgSCM 0,025 г, Са(МОз)2 0,1 г. КНаР04 0,025, К2СОз 0,0345, вода дистиллированная до 1 л, рН после стерилизации 7,0-7,3) в люминостате с освещенностью 2000 люкс и содержащую 5-10 клеток в. 1 мл, вносят растворы испытуемых веществ в различных дозах (0,001; 0,01 и 1.0 мг/л). Спустя 30-40 мин после внесения испытуемых веществ в культуру инфузорий вносят по 2,97 МБк Н3-тимидина и 2,97 МБк Н3 - УТФ на 150 мл культуральной жидкости и производят инкубацию в течение 30 мин при 27-28° С. После окончания инкубации каждую пробу разделяют на 3 равные части, соответственно по 50 мл каждую, охлаждают и вносят хлорную кислоту до 5% конечной концентрации. Образцы охлаждают в течение 30 мин и сформировавшийся осадок собирают центрифугированием при 1000 g в течение 10 минут. Полученные осадки трижды промывают 5% хлорной кислотой, после чего из осадков извлекают тотальную РНК. Для этого к ним прибавляют 0,3 н гидрат окиси калия, суспендируют и производят инкубацию образцов при 37° С в течение 1,5 ч. После окончания инкубации

пробы охлаждают и вносят хлорную кислоту до 5% концентрации, через 15 мин их центрифугируют при 1000 g в течение 10 минут, затем собирают надосадочную жидкость,

5 которая представляет нуклеотиды РНК. Полученные осадки промывают 2 мл 5% HCI04, после чего осадки объединяют с первой надосадочной жидкостью и в общем объеме определяют содержание РНК по из0 вестному методу Спирина.

По 0,5 мл из каждого образца вносят во флаконы с диоксановым сцинтиллятором и определяют радиоактивность на сцинтил- ляционном счетчике, результаты выражают

5 в импульсах в минуту на 1 мг РНК (удельная радиоактивность РНК).

Осадок, полученный после выделения РНК, гидролизуют в 5% HCI04 на водяной бане при 90-95° С в течение 20 мин с

0 обратным холодильником. Надосадочную жидкость переносят в чистые пробирки и определяют содержание ДНК и удельную радиоактивность.

Полученные значения для трех парал5 лельных проб усредняют и сравнивают удельные радиоактивности контрольных и опытных образцов. Уменьшение величин удельной радиоактивности свидетельствует об угнетении скорости синтеза нуклеиновых

0 кислот, а в случае увеличения удельной радиоактивности - об увеличении скорости синтеза РНК или ДНК.

Достоверное увеличение или уменьшение удельной радиоактивности нуклеино5 вых кислот по сравнению с контролем указывает на проявление генотоксичности исследуемых веществ.

Пример1.В 3-х суточную культуру Tetrahymena pyriformls, растущую на пеп0 тонной среде при 27° С, вносили по 2,97 МБк Н3-тимидина и 2,97 МБк Н3-УТФ и выдерживали в термостате при 28° С. Спустя 20, 40, 60, 80 и 100 мин извлекали пробы, охлаждали и в каждую из проб вносили

5 хлорную кислоту до конечной концентрации 5%. Из полученных осадков щелочным или кислотным гидролизами извлекали РНК и ДНК и определяли их удельную радиоактивность.

0 В 5-ти суточную культуру водорослей Chlorella vulgaris вносили по 2,97 МБк Н3- тимидина и 2,97 МБк Н3-УТФ и спустя 10,20, 30 и 40 мин извлекали пробы, охлаждали и вносили в каждую из них хлорную кислоту

5 до конечной концентрации 5%. Осадки собирали центрифугированием, из них извлекали РНК и ДНК и определяли их удельную радиоактивность.

В табл. 1 приведены результаты опреде- ления удельной радиоактивности ДНК и

РНК в клетках водорослей и в клетках инфузорий при различности времени экспозиции и эти приведенные данные показывают, что при экспозиции до 30 минут удельная радиоактивность ДНК и РНК в клетках водорослей увеличивается, а при дальнейшем увеличении времени экспозиции эта величина остается неизменной, а в клетках инфузорий эта величина увеличивается при экспозиции до 60 мин.

Данные опытов показывают, что доза изотопов 2,97 МБк является достаточнрй, чтобы получить высокую удельную радиоактивность нуклеиновых кислот в клетках водорослей и инфузорий соответственно. видно из полученных результатов, оптимальным времени экспозиции является 30- 60 мин.

П р и м е р 2. В 3-х суточную культуру инфузорий Tetrahymena pyriformis, растущую на пептонной среде при 27° С, вносили 0,5 мг/л меди и спустя 10, 20, 30 и 40 минут извлекали пробы культуры. В каждую из проб вносили 2,97 МБк Н -тимидина и 2,97 МБк Н3-УТФ. Затем производили инкубацию каждых образцов в течение 60 минут при 28° С, после чего охлаждали и вносили холодный раствор хлористой кислоты до 5% конечной концентрации. Через 30 мин осадок собирали центрифугированием при ЮООд в течение 10 мин, после чего для каждого образца определяли удельную радиоактивность ДНК и РНК в клетках инфузорий с разной продолжительностью экспозиции.

Результаты опытов приведены в табл. 2.

Данные опытов показывают, что при внесении 0,5 мг/л меди в среду с инфузориями и экспозиции их до 20-30 мин до внесения в культуральную среду меченных предшественников нуклеиновых кислот, наблюдается достоверное снижение удельной радиоактивности нуклеиновых кислот, Это снижение коррелируют с угнетением роста культуры через 24 и 48 ч после внесения токсиканта,

При сравнении влияния 0,5 мг/л меди на удельную радиоактивность нуклеиновых кислот и отдельно на подвижность инфузорий, определяемую способом по прототипу, обнаружено, что если подвижность изменяется на 26%, то удельная радиоактивность ДНК изменяется через несколько минут после внесения токсиканта на 50%. Таким образом, изменение удельной радиоактивности нуклеиновых кислот е клетках инфузорий или водорослей фиксируют внесением радиоактивных предшественников в культуральную среду через 20-30 мин после внесения токсиканта, что в несколько раз быстрее по сравнению с учетом численности клеток.

Предлагаемый способ обеспечивает большую чувствительность по сравнению с оценкой токсичности, проводимой по изменению подвижности тест-обьектов, кроме

того, он позволяет оценить не только общую токсичность, но и генотоксичность, т.е. токсичность, затрагивающую генетическую систему клеток.

ПримерЗ. Культуру водорослей

0 Chlorella vulgaris, растущую на среде Успенского в люминостате с освещенностью 2000 люкс при температуре 20° С, разделяли на отдельные пробы, в каждую из которых вносили Соответственно 0,005; 0,01; 0,1 или

5 0,5 мг/л ртути. Спустя 30 мин после внесения токсиканта в каждую из проб вносили по 2,97 МБк Н3-тимидина и через 30 мин культуру охлаждали и клетки осаждали хлорной кислотой, после чего определяли удель0 ную радиоактивность ДНК.

Результаты опытов, представленные на фиг. 1 и 2. показывают, что ионы ртути в концентрации 0,005 и 0,01 мг/л не оказали влияния на скорость синтеза ДНК, а доза в

5 0,1 мг/л подавляла скорость ДНК на 96%. Увеличение дозы токсиканта в 5 раз полностью подавляло включение радиоактивной метки в ДНК (на 99%). Влияние этих доз ртути на численность клеток водорослей че0 рез 3, 6, 9 и 12 суток после начала эксперимента не оказывалось, что указывает на существование механизма адаптации.

Генотоксичность, определяемая через 30-60 мин после внесения токсиканта по

5 скорости синтеза ДНК. позволяет оценить прямое влияние испытуемых веществ на функцию генетического аппарата без наложения адаптивных способностей тест-объектов.

0 Таким образом, предлагаемый способ позволяет определять концентрации веществ, оказывающих влияние на генетический аппарат водорослей,

П р и м е р 4. Культуру водорослей

5 Chlorella vulgaris, растущую на среде Успенского в люминостате с освещенностью 2000 люкс при температуре 20° С, разделяли на отдельные пробы, в каждую из которых вносили соответственно 0,05; 0,1; 0,25; 0,5 и

0 1,0 мг/л кадмия. Спустя 30 минут после внесения токсиканта в каждую из проб вносили по 2,97 МБк Н3-тимидина и через 30 мин культуру охлаждали и клетки осаждали хлорной кислотой, после чего определяли удель5 ную радиоактивность ДНК.

Таким образом, предлагаемый способ оценки генотоксичности позволяет в короткое время дать ответ о влиянии испытуемых веществ на функцию генетического аппарата тест-объектов.

П р и м е р 5. 3-суточную культуру инфузорий Tetrahymena pyriformls, растущую на пептонной среде, разделяли на отдельные пробы, в каждую из которых вносили соответственно 0,1; 0,5 и 1,0 мг/л ионов меди. Спустя 30 мин после внесения токсиканта вносили по 2,97 МБк Н3-тимидина и Н3- УТФ. После 60 минут инкубации культуру охлаждали и клетки осаждали хлорной кислотой, после чего определяли удельную радиоактивность ДНК и РНК,

Медь в концентрации 0,1 мг/л снижает удельную радиоактивность ДНК и клетках инфузорий на 34%, а увеличение концентрации до 0,5 и 1,0 мг/л уменьшает этот показатель на 65 и соответственно. Удельная радиоактивность тотальной РНК при внесении 0,1 мг/л меди понизилась на 50% по сравнению с контролем. Увеличение концентрации меди в среде в 5 и 10 раз не приводило к дальнейшему изменению удельной радиоактивности РНК клеток инфузорий. Инкубация клеток с ионами меди в концентрации 0,1 мг/л снижало численность инфузорий на 60% через 24 ч после ее внесения в культуральную среду. Дальнейшее увеличение концентрации меди в среде не влияло на интенсивность размножения инфузорий.

Таким образом, медь обладает ге- нотоксичностью, и предлагаемый способ оценки генотоксичности позволяет в короткое время дать ответ о влиянии испытуемых

веществ на функцию генетического аппарата инфузорий.

Формула изобретения Способ определения генотоксичности водорастворимых веществ, включающий

внесение исследуемых веществ в культуральную среду инфузорий Tetrahymena pyrlformis и экспозицию их с исследуемым веществом,отличающийся тем,что,с целью повышения чувствительности и достоверности определения и расширения области использования, после внесения исследуемого вещества в культуральную среду дополнительно через 20-30 мин производят инкубацию инфузорий в течение

30-60 мин с меченным предшественником, после чего определяют удельную радиоактивность тотальных ДНК и РНК в клетках инфузорий, а о генотоксичности исследуемых веществ судят по оценке их влияния на

удельную радиоактивность нуклеиновых кислот инфузорий,

2. Способ поп. 1,отличающийся тем, что культуральная среда дополнительно содержит водоросли Chtorella vulgarls

Использование: микробиологии, водная токсикология, биологический контроль за токсичными водорастворимыми веществами, контроль сточных и природных вод, оценка генотоксичности. Сущность изобретения; определение генотоксичности проводят . внесением исследуемых веществ в культуральную среду инфузорий Tetrahymena pyrlformis и экспозицией с меченным предшественником. После чего определяют удельную радиоактивность тотальных ДНК и РНК в клетках инфузорий, по изменению удельной радиоактивности нуклеиновых кислрт судят о генотоксич- ности исследуемых веществ. Дополнительно могут быть использованы водоросли Chlorella vulgaris. 2 табл.

Таблица 1

Продолжение табл.1