Применение супероксиддисмутазы 2 в качестве антиоксиданта в сверхмалых дозировках Российский патент 2024 года по МПК C12N9/02 

Область техники

Изобретение относится к области биотехнологии, биологии и сельского хозяйства и касается применения супероксиддисмутазы 2 (СОД2) в качестве активатора экспрессии гена СОД2 для увеличения синтеза собственной внутриклеточной СОД и стимуляции антиоксидантной защиты в сверхмалых дозировках.

Данный препарат может быть эффективно использован для лечения воспалительных, инфекционных, сердечно-сосудистых, онкологических и нейродегенеративных заболеваний.

В сельском хозяйстве препарат может быть применен в животноводстве, повышая иммунную резистентность животных. В растениеводстве препарат может повышать стрессоустойчивость к факторам внешней среды, активировать выход зеленой массы и вызывать повышение урожайности сельскохозяйственных культур.

Применение препарата возможно в виде водных растворов, сухом виде для энтерального применения. В виде стерильных растворов для парентерального введения. В сельском хозяйстве в виде сухого вещества для приготовления водных растворов для полива и использовании в растворах для гидропонного выращивания растений.

Супероксиддисмутаза (СОД, КФ 1.15.1.1) относится к группе антиоксидантных ферментов. Она защищает организм человека от постоянно образующихся высокотоксичных кислородных радикалов. Супероксиддисмутаза катализирует дисмутацию супероксида в кислород и пероксид водорода. Следовательно, фермент играет большую роль в антиоксидантной защите многих клеток, находящихся в контакте с кислородом.

Фермент присутствует во всех аэробных организмах. В организме млекопитающих СОД2 локализована в митохондриальном матриксе. У человека супероксидисмутаза 2 кодируется геном SOD2 на хромосоме 6.

Уровень техники

В литературе широко описано использование супероксиддисмутазы ив качестве антиоксиданта. Однако нигде в литературе не встречается упоминание о влиянии сверхмалых доз на живые организмы.

Описано использование фермента супероксиддисмутазы в различных отраслях.

Так, в патентной литературе раскрыто использование супероксиддисмутазы в медицине, в косметологии, в сельском хозяйстве, в пищевой промышленности и т.д.

В патенте RU 2600843, опубликованном 27.10.2016, раскрыта композиция для профилактики или снижения риска развития метаболических дисфункций, связанных с ожирением, содержащая Saccharomycescerevisiaevarboulardii в количестве между 106 и 109 колониеобразующих единиц (КОЕ) на суточное введение и фермент супероксиддисмутазу в количестве между 1 и 100 мг.

В патенте RU 2557894, опубликованном 27.07.2015, раскрыто косметическое средство для быстрого восстановления кожи, содержащее супероксиддисмутазу, витамин группы В, янтарную кислоту, отличающееся тем, что дополнительно содержит водорастворимый аналог витамина Е тролокс и L-аргинин, активность супероксиддисмутазы составляет 200000- 300000 ЕД/мг, витамин группы В представлен декспантенолом, соотношение компонентов, мас. %: супероксиддисмутаза 0,01-32, декспантенол 0,1-20, янтарная кислота 0,5 - до рН 6,0, тролокс 0,13-45, L-аргинин 0,9-64, вода для инъекций - остальное.

В патенте RU 2789458, опубликованном 03.02.2023, описан способ повышения иммунного статуса пчелиных семей, зараженных нозематозом, подкормкой, полученной путем обогащения сахарного сиропа 1:1 высокомолекулярным антиоксидантным препаратом S.O.D. - супероксиддисмутаза + каталаза + глутатионпероксидаза, растворенным предварительно в воде, предназначенным для 3-кратной подкормки с периодичностью в 12 дней препаратом в дозировках 100 мг, 200 мг и 300 мг.

В патенте GB 2183658, опубликованном 10.06.1987, описана марганецзависимая супероксиддисмутаза MnSOD(SOD2), которую можно использовать для катализа восстановления супероксидных радикалов, уменьшения реперфузионного повреждения, продления времени выживания изолированных органов или лечения воспалений.

Патент CN 101420973, опубликованный 29.04.2009, относится к композициям, адаптированным для фармацевтического введения, содержащим по меньшей мере одну супероксиддисмутазу и по меньшей мере один пептидный фрагмент на основе проламина.

Раскрытие сущности изобретения.

Неожиданно авторами настоящего изобретения обнаружена способность фермента супероксиддисмутазы в сверхмалых дозах оказывать значительный эффект на экспрессию гена, кодирующего синтез внутриклеточной СОД2, с последующим выраженным антиоксидантным эффектом в живых организмах.

Таким образом, настоящее изобретение относится к применению супероксиддисмутазы 2 в качестве активатора экспрессии гена СОД2 для увеличения синтеза собственной внутриклеточной СОД и стимуляции антиоксидантной защиты в разведении от 10^-12 до 10^-200.

Технический результат настоящего изобретения заключается в эффективности использования супероксиддисмутазы 2 в качестве активатора экспрессии гена СОД2 для увеличения синтеза собственной внутриклеточной СОД и стимуляции антиоксидантной защиты в сверхмалых дозировках в разведении от 10^-12 до 10^-200.

В качестве супероксиддисмутазы 2 использовался рекомбинантный белок супероксиддисмутазы 2 человека, митохондриальный (SOD2) (NM_001024465) MVPro, производства OriGeneTechnologiesInc, USA. Использованная доза 10 мг. Указанная доза растворяется в стеклянном флаконе емкостью 3мл с винтовой крышкой в 99 каплях этилового спирта. Производится первичная динамизация матричного раствора путем ударов, зажатого в кулаке флакона, по кожаной подушке 10 раз. Полученный таким образом матричный раствор переносится во флакон с винтовой пробкой емкостью 200 мл, растворяется бидистилированной водой в объеме 99 мл, перемешивается и встряхивается о подушку 11 раз. Подобный процесс повторяется в новых одноразовых флаконах до получения всего спектра сотенных потенций от матричной до СН 200 (отечественная потенция С200), каждая последующая потенция прибавляет по одному удару до 40. Таким образом получали фермент в необходимом разведении от 10^-12 до 10^-200.

Осуществление изобретения

Проводили эксперименты при разведении супероксиддисмутазы 2, препарат В1 - разведение 10^-12 и препарат В2 - 10^-200, тест-объект Цериодафния, вид Ceriodaphnia dubia. Объект опыта - Цериодафния, вид Ceriodaphnia dubia(C 2016 года так обозначают группу трудноразличимых видов Цериодафния, куда входит собственно С.dubia, С.affinis и еще несколько видов. Во всех отечественных методиках этот вид называется С.affinis, но согласно WoRMS и мнению д.б.н. А.А. Котова правильно называть ее С.dubia.). Они мельче дафний, что усложняет с ними работу, но их срок жизни короче, всего около 2 месяцев, а потому нам удалось получить результат быстрее, чем при проведении экспериментов на дафниях, рыбах или мышах.

В каждой линии использовали по 20 Цериодафний с индивидуальной рассадкой в пенициллиновые пузырьки объемом 10 мл.

В опыте участвовали следующие линии:

К0 Чистый контроль (с добавками чистой воды 2 раза в неделю для единства манипуляций);

К Контроль с добавками физраствора 2раза в неделю на протяжении месяца (для сравнения с B1, В2);

К + Контроль с добавками физраствора 2раза в неделю на протяжении всего опыта (для сравнения с В1+, В2+,);

81 Опытные повторности с добавками препарата В1 2раза в неделю на протяжении месяца;

82 Опытные повторности с добавками препарата В2 2раза в неделю на протяжении месяца;

В1+ Опытные повторности с добавками препарата В1 2раза в неделю на протяжении всего опыта (58 суток);

В2+ Опытные повторности с добавками препарата В2 2раза в неделю на протяжении всего опыта (58 суток).

Всего: 7 линий по 20 пенициллиновых пузырьков =140 пенициллиновых пузырьков =140 Цериодафний.

Основными показателями изменения состояния организма служили параметры выживаемости, плодовитости и продолжительности жизни по сравнению с контрольными животными. Измерение этих параметров проводили 2-3 раза в неделю. Два раза в неделю среду в опыте заменяли на новую, и, соответственно, осуществляли добавки препарата. Эксперимент продолжали до момента гибели последней цериодафний в наблюдаемых выборках. Общая длительность опыта составила 58 суток.

Результаты, полученные в ходе проведения эксперимента

На протяжении первых двух недель опыта наилучшую выживаемость наблюдали в линиях с добавками В₂ (95-100%) (табл. 2). На 31 сутки эксперимента численность рачков во всех исследуемых линиях упала до 50% и ниже (табл. 2;). При этом выживаемость в повторностях с добавками B₁ и В₂ были выше, чем при добавлении физраствора.

На 29 сутки опыта выживаемость С.Dubia при добавках чистого физраствора была выше, чем в нулевом контроле без его добавления (табл. 3).

По показателю средней продолжительности жизни Ceriodaphnia dubia в исследуемых линиях к 30 суткам опыта нами обнаружен статистически значимый стимулирующий эффект на 13,7 и 12,4% соответственно для препаратов В1 и В2 по сравнению с добавками чистого физраствора.

Максимальная продолжительность жизни особей в течение всего опыта составляла для препарата В1+ 58 суток, а для чистого физраствора - 47 суток. Таким образом, обнаружен эффект увеличения максимальной продолжительности особей цериодафний в 58-суточном эксперименте.

Таким образом, нами были изучены препараты В1 и В2 с использованием в качестве тест-объекта цериодафний Ceriodaphnia dubia в ходе 1- и 2-месячных экспериментов при добавлении их в среду в режиме добавки 2 раза в неделю в течение 1 и 2 месяцев.

По результатам биотестирования на 29 сутки опыта эффект на выживаемость рачков С.dubia при добавках препарата В2 и В1 был выражен лучше, чем при добавлении чистого физраствора.

По показателю средней продолжительности жизни Ceriodaphnia dubia в ходе 1-месячного эксперимента обнаружен статистически значимый стимулирующий эффект на 13,7 и 12,4% соответственно для препаратов В1 и В2 по сравнению с добавками чистого физраствора.

Следует отметить, что для такого важного общебиологического интегрального показателя как средняя продолжительность жизни отмеченное нами увеличение срока жизни рачков Ceriodaphnia dubia на 12-14% является весьма существенным.

По показателю максимальной продолжительности жизни особей цериодафний в 58-суточном эксперименте для препарата В1+ обнаружен эффект увеличения максимальной продолжительности жизни особей на 10 суток по сравнению с чистым физраствором.

Следующий эксперимент проводили с микроводорослями.

В1- супероксиддисмутаза 2 в разведении 10^-12

В2- супероксиддисмутаза 2 в разведении 10^-200

Тест-объектом исследования являлась альгологически чистая культура зеленой хлорококковой микроводоросли Scenedesmusquadricauda (Тиф.) Breb.(=Desmodesmuscommunis (E.Hegew.)E. Hegew.), широко распространенная в пресных водоемах Южного и Северного полушария и являющаяся важным звеном в их трофических цепях.

S. quadricauda получена из коллекции культур водорослей кафедры микробиологии Биологического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова (DMMSU, штамм S-3). Данный вид водорослей относится к ценобиальным организмам. Чаще встречаются 2- и 4-клеточные ценобии, реже - 8- и 16-клеточные. При размножении в каждой клетке образуются автоспоры, которые внутри материнской клетки слагаются в молодую колонию. Данный вид широко используется в мировой практике в биотестировании по оценке качества водной среды и токсичности различных соединений и материалов.

Культуру выращивали на среде Успенского №1 (состав, г/л: 0,025 KNO3, 0,025 MgSO4, 0,1 KH2PO4, 0,025 Ca(NO3)2, 0,0345 K2CO3, 0,002 Fe2(SO4)3; рН 7,0-7,3) в люминостате при освещенности 3,5 клк со сменой дня и ночи (12:12 ч), температуре 22±2°С и перемешивали 2 раза в сут во избежание оседания клеток.

Тест-культуру предварительно адаптировали к веществам В1 (фермент супероксиддисмутаза 2 в разведении 10^-12) и В2 (фермент супероксиддисмутаза 2 в разведении 10^-200). Для этого с момента посева культуры на питательную среду с исходной численностью 40 тыс кл/мл вещества добавляли в культуру по следующей схеме:

B1 добавляли в колбы с культурой (объемом 50 мл) каждый рабочий день (на 0, 1, 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 14 сутки адаптации) по 0,1 мл.

B2 добавляли в том же объеме, но два раза в неделю, в понедельник и пятницу (0, 4, 7, 11, 14 сутки адаптации).

Данные роста культуры в процессе добавления веществ В1 и В2 представлены в табл. 6.

Как видно из табл. 6, рост культуры в процессе адаптации к веществам В1 и В2 практически не отличался от контрольной неадаптированной культуры в течение всего 14 суточного периода адаптации. При этом во всех вариантах, включая контроль, абсолютная численность клеток в кл/мл за 14 суток адаптации возрастала примерно в 60 раз от 40 тыс кл/мл (в день посева) до 2,5 млн кл/мл.

По данным люминесцентной микроскопии доля живых клеток во всех вариантах и на все сроки наблюдения была на уровне контроля и составляла 97-99%.

На седьмые сутки добавки веществ была зафиксирована стимуляция показателя эффективности фотосинтеза по сравнению с контролем на 10% для вещества В2 и на 24% для вещества В1 (табл. 7).

Эксперимент с эталонным токсикантом бихроматом калия

На 14 сутки адаптации из колб с чистым контролем и колб с адаптированными к веществам В1 и В2 клетками водоросли, был взят инокулят для проведения основной части опыта с токсикантом. В этот же день поставлен эксперимент по изучению ответных реакций чистой и адаптированной к веществам В1 и В2 культуры Scenedesmusquadricauda на стандартный токсикант бихромат калия. Токсикант был взят в концентрациях 0,1; 1 и 5 мг/л (малая, средняя и высокотоксичная концентрации)бихромата калия. Численность клеток водорослей в каждой колбе составляла 40 тыс кл/мл. Объем питательной среды с культурой в каждой колбе - 50 мл. Для каждой исследованной концентрации токсиканта (0,1, 1 и 5 мг/л), и каждого типа культуры (чистой, адаптированной к В1, адаптированной к В2) были взяты по три повторности, всего 27 колб. В качестве контроля были взяты три колбы с чистой культурой без добавления токсиканта. Итого 30 колб.

Измерения проводили на 1, 3, 7, 10 и 14 сутки хронического опыта.

Исследуемые показатели - численность клеток, эффективность фотосинтеза и доля живых клеток в культуре.

Как видно из табл. 8, значительная стимуляция фотосинтеза культуры(на 15-76%) отмечена для всех случаев опыта с разными концентрациями токсиканта у адаптированных к веществам В1 и В2 культур уже на первые сутки опыта. При этом у адаптированных культур к В2 стимулирующий эффект был выражен сильнее. Так разница с контролем у адаптированных к В2 культур с разными концентрациями токсиканта была на 41-76%. Контролями в данном случае был фотосинтез в присутствии соответствующих концентраций токсиканта уже адаптированных к веществу культур. А разница с контролем у адаптированных к В1 культур при разных концентрациях токсиканта была на 15-29%.

Таким образом, нами был выявлен эффект уменьшения токсичности при всех исследованных концентрациях бихромата калия у адаптированных к веществам В1и В2 культур по физиологическому показателю - величине эффективности фотосинтеза, что может свидетельствовать о быстром (уже на первые сутки опыта) процессе интенсификации обменных процессов у адаптированных к веществам культур для детоксикации тяжелого металла хрома (в составе бихромата калия). В токсикологии этот показатель позволяет выявить более ранний ответ на токсическое воздействие по сравнению с интегральными показателями численности или выживаемости особей, слагающих популяцию (в данном случае популяции клеток водоросли).

Известно, что стимуляция процесса фотосинтеза может служить показателем ускорения выведения излишка токсичного металла из клетки. Этот процесс является одним из важных внутриклеточных механизмов детоксикации токсичного металла.

Таким образом, препараты В1 и В2 обладают антиоксидантным свойством, снижая токсическое влияние тяжелого металла хрома и уменьшая его токсичность для исследованного тест-объекта при разных уровнях интоксикации.

Экспериментально в длительном опыте на большом количестве поколений клеток тест-объекта показано снижение токсического влияния бихромата калия при разных уровнях его воздействия под действием препаратов В1 и В2.

Следующий эксперимент был проведен на курах-несушках кросса «Ломанн белый ЛСЛ» в возрасте 96-100 недель. Опытную и контрольную группу сформировали по принципу пар-аналогов с учетом яйценоскости и массы яйца, птица была разделена на 2 группы по 41 голове в каждой.

Куры контрольной и опытной группы получали полнорационный комбикорм в соответствии с рекомендациями производителя кросса. Птица опытной группы 2 раза в неделю получала экспериментальную кормовую добавку, представляющую собой препарат В2, т.е. супероксиддисмутазу 2 в разведении 10^-200, нанесенный на сарахную крупку размером 38-41 шт в 1 грамме, а птица контрольной группы получала плацебо.

В конце эксперимента по 5 особей из каждой группы подвергли эвтаназии. Образцы тканей печени и миокарда отобрали для оценки экспрессии гена супероксиддисмутазы.

Были выполнены молекулярно-генетические исследования. Тотальную РНК из образцов выделяли вручную при помощи набора RNeasyMiniKit (QIAGEN, Германия) согласно протоколу. Количественная оценка выделенной РНК была выполнена на флуориметре Qubit 3.0 (Thermo Fisher Scientific, США) с помощью набора Qubit RNA HS (HighSensitivity) AssayKit (Thermo Fisher Scientific, США).Синтез кДНК из матрицы РЖ проводили с помощью набора iScriptcDNAsynthesiskit (Bio-Rad, США) с использованием термостата «Гном» (ДНК-Технология, Россия). Полимеразная цепная реакция в реальном времени была выполнена на амплификаторе LightCycler 96 (Roche, Швейцария) с использованием 96-луночных планшетов и с использованием мастер-микса PowerUp SYBR GreenMasterMix (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, США).Температурный профиль реакции амплификации состоял из: 95°С в течение 10 минут; 40 циклов при 95°С в течение 15 секунд, включая отжиг праймеров по индивидуальной температуре в течение 30 секунд и 72°С в течение 30 секунд. Каждый образец исследовался в трех повторах на ПЦР планшете. Количество кДНК на каждую ПЦР реакцию составило 2 мкл при концентрации праймеров равной 0,32 мкМ. Расчет экспрессии гена SOD относительно контрольного гена (ген домашнего хозяйства) был выполнен вручную с помощью Microsoft Office Excel с использованием метода 2^-ΔΔCt. Полученные зоотехнические и молекулярно-генетические данные считали достоверными при р<0.05.

Из данных таблицы 9 можно сделать вывод, что экспрессия гена супероксиддисмутазы 2 в миокарде в опытной группе на 4% выше, чем в контрольной.

Таблица 10. Экспрессия гена супероксиддисмутазы 2 в печени

Из данных таблицы 10, можно сделать вывод, что экспрессия гена супероксиддисмутазы 2 в паренхиме печени в опытной группе на 28% выше, чем в контрольной.

Таким образом, в результате эксперимента был получен следующий результат: Экспрессия гена супероксиддисмутазы 2 в опытной группе повысилась на 4% в ткани миокарда и на 28% в паренхиме печени.

Таким образом, использование супероксиддисмутазы 2 (СОД2) в сверхмалых дозах, а именно, в разведении от 10^-12 до 10^-200 позволяет восстановить и поддерживать на оптимальном уровне экспрессию гена супероксиддусмутазы 2, тем самым повышая собственный внутриклеточный синтез фермента, с обеспечением выраженных системных биологических реакций.

Суммируя вышеизложенное, проведенные эксперименты позволяют утверждать, что супероксиддисмутазу 2 (СОД2) можно применять в качестве активатора экспрессии гена СОД2 для увеличения синтеза собственной внутриклеточной СОД и стимуляции антиоксидантной защиты в сверхмалых дозах, а именно, в разведении от 10^-12 до 10^-200.

Изобретение относится к области биотехнологии, биологии и сельского хозяйства и касается применения супероксиддисмутазы 2 в качестве активатора экспрессии гена СОД2 для увеличения синтеза собственной внутриклеточной СОД и стимуляции антиоксидантной защиты в сверхмалых дозировках, а именно в разведении от 10^-12 до 10^-200. Изобретение позволяет эффективно использовать супероксиддисмутазу 2 в качестве антиоксиданта в сверхмалых дозировках в разведении от 10^-12 до 10^-200. 10 табл.

Применение супероксиддисмутазы 2 в разведении от 10^-12 до 10^-200 в качестве активатора экспрессии гена СОД2 для увеличения синтеза собственной внутриклеточной СОД и стимуляции антиоксидантной защиты.