Способ очистки @ -ингибитора протеиназ Советский патент 1993 года по МПК G01N33/53 C07K15/06 

. Изобретение относится к медицине, биологии, а именно к биохимии, и может быть использовано в промышленном производстве белковых препаратов и медицинских диагностикумов.. Целью изобретения явилась разработка высокоэффективного способа очистки ИП из плазмы крови человека.

Поставленная цель достигается тем, что на I этапе очистки плазма крови человека пропускается.через гель голубой агарозы; фракции, содержащие ИП, собираются и ди- . ализуются против буфера для внесения, за- тем проводится аффинная хроматография на органортутной агарозе, с которой ИП ко- валентно связывается и отделяется в дальнейшем дитиотрейтолом. Окончательная доочистка ИП происходит на медной форме иминодиуксуснокислой агарозы.

Принципиальные отличия предлагаемого способа и его новизна состоят в том,-что на I этапе ИП отделяется от большей части сывороточного альбумина, его препарат,, в итоге, не содержит другие ингибиторы про- теиназ (антитромбин Ш, альфа2-макрогло- булин, антихимотрипсин), а также ряд других белков-плазмы, тогда как потери самого ИП не превышают 5% (3). На II этапе очистки молекулы ИП, содержащие свободную SH-rpynny цистеина, высокоселективно связываются со ртутью, находящуюся в составе органортутного сорбента. У большинства других сывороточных протеинов свободные SH-группы в структуре молекулы отсутствуют. Затем дитиртрейтол в достаточно мягких условиях разрывает возникшую ковалентную связь. Поэтому, на этом. этапе потери ИП не превышают 25% (около 5% ИП совершенно не взаимодействуют с органортутной агарозой, следовательно,, при контакте с матрицей теряется только 20% белка). На последнем этапе очистки ИП более прочно связывается с медной формой иминодиуксуснокислой агарозы, чем мер- каптоальбумин и другие меркаптопротеи- ны, поэтому на выходе мы имеем иммунохимически чистый белок, а его потери составляют здесь лишь 12%. Таким образом, общие потери ИП в ходе всей очистки не превышают 37,5%, а выход белка равняется 62,5%, что почти в 2 раза больше, чем в способе-прототипе. Кроме того, предлагаемый биотехнологический цикл очистки ИП не превышает 3 сут, что более чем в 2 раза короче; чем в способе-прототипе.

Поданным зонального электрофореза в градиенте пор лолиакриламидного геля, так и электрофореза по методу Лэммли молекулярная масса ИП была 53 КДа, а посторонние белки в его препарате отсутствовали.

При проведении перекрестного иммуноэлек- трофореза с полисывороткой против всех белков плазмы крови человека получен единственный иммупреципитат, обладаю5 щий подвижностью альфат-глобулинов. Выделенный нами ИП в условиях иммуно- диффузии реагировал с моноспе цифической антисывороткой против.альфа1-ингибитора протеиназ фирмы Sigma (США). ОчищенЮ ный нами ИП в эквимолярнрм с трипсином (Sigma, США) соотношении подавлял его протеолиГтическую активность (субстрат азоказеин) на 95.%, а амидазную активность (субстрат Ы-бензоил--01-аргинил -паранит15 роанилид) более чем на 85%. Эти данные свидетельствуют о значительной нативно- сти полученного нами белка.

. Отсутствие подобных способов очистки ИП, которые обеспечивали бы значитель20 ный выход нативного белка высокой степени чистоты наряду с сокращением продолжительности всего биотехнолргиче- ско.го цикла, свидетельствует о соот ветст. вии технического, решения критериям

25 новизна и существенные отличия.

Пример 1. 150 мл плазмы крови человека диализуется в течение против 4°С против 4 литров 0,03 М фосфатного буфера, рН 7,0. Затем диализат пропускается со ско30 ростью 20 мл/ч через гель голубой агарозы . (малое предприятие Эстар, ЭССР), имеющий объем 400 мл и находящийся в колонке . 2,5 см х ТОО см. Голубая агароза предварительно уравновешивается указанным выше

35 буфером. Сбор фракций осуществляется

. коллектором DJAFRACD-002 (НПО Диагностикум. г.Львов), объем каждой фракции

. 10 мл. Поскольку ИП с голубой агарозой

практически не взаимодействует, фракции,

40 его содержащие, относятся к наиболее ранним и выявляются по методу Веремеенко(7), основанному на способности ИП подавлять гидролиз трипсином 1 1-бензоил-О1:-арги- нил-паранитроанилида (БАПНА). Эти фрак45 ции сливаются и диализуются в течение

ночи против 4 литров 0,01 М трис-солянокислого буфера, рН 7,0, содержащего 0,01 М

трилона Б. 0,1 М хлористого натрия, 0,1%

.додецилсульфата натрия. Указанным буфе50 ром предварительно уравновешивается хроматографическая колонка 2 см х 20 см, заполненная.50 мл органортутной агарозы (малое предприятие Эстар, ЭССР). Диали: зат пропускается через данную колонку со

55 скоростью 2 мл/ч. Отмывка органортутной агарозы проводится исходным уравновешивающим буфером до нулевой оптической плотности (Е 280 нм). Элюция осущест- оляется зышаназаанным буфером, дополненным 0,01 М дитиотрейтола (Reanal,

Венгрия). Сбор белоксодержащ.их фракций проводится под контролем спектрофотометра (Е 280 нм). Эти фракции собирают- ся и диализуются в течение суток против четырех литров 0,02 М фосфатного буфера, рН 8,0, содержащего 1 М хлористого натрия, который служит стартовым буфером для последующей металл-хелатной хро- матографии. 10 мл иминодиуксуснокислой агарозы (малое предприятие Эстар, ЭССР) помещают в колонку 2.см х 5 см и гель .трансформируют в медь-хелатную форму (медь бивалентна) следующим образом. Первоначально он промывается 50 мл 0,05 М раствора трилона Б, приготовленного на основе 0,5 М раствора хлористого натрия, затем промывается 50 мл дистиллированной воды, затем 50 мл 0,05 М раствора аце- тэта меди. После чего следует отмывка 50 мл дистиллированной воды .и уравновешива ние геля вышеуказанным стартовым фосфатным буфером. Диализат пропускается через активированный гель со скоростью 10.мл/час. Далее; колонку отмывают стартовым буфером до нулевой оптической плотности, Меркаптоальбумин и другие примесные белки удаляют 0,02 М натрийфосфатным буфером, рН 6,0, содержащим 1 М хлористого натрия. После завершения

отмывки геля ИП элюируют 0,02;М буфером N32HP04 -лимонная кислота. рН 5,0, содержащим 1 М хлористого натрия. Следует отметить, что использованные в изобрете- нии матрицы малого предприятия Эстар. (Тарту, ЭССР) изготовлены по временным техническим условиям предприятия/кото- рые являются коммерческой тайной.

.. С целью проверки чистоты ИП проводи- ли электрофорез в градиенте пор полиакри- ламидного геля, зональный электрофорез по методу Лэммли, иммуноэлектрофорез с антисывороткой против всех белков сыво-

ротки крови человека (НИИЭМ, Нижний, Новгород). Во всех этих тестах детектиро вался единственный одноцепочечный протеин с молекулярной массой 53 К Да, обладающий альфат-электрофоретической подвижностью глобулинов. Выделенный нами ИП реагировал с моноспецифической ан- тисыворрткой против альфаг-ингибиторов протеиназ, (Sfgma, США). В функциональных тестах ИП практически полностью подавляя амидазную и протеолитическую. активность трипсина (более чем на 85% и 95%, соответственно). Таким образом, на- тивность и высокая степень очистки препа-. рата ИП доказана. .. . . Пример 2. Выделенный нами ИП мы использовали для иммунизации кроликов. Иммунизацию проводили по стандартным схемам в течение Т года. Даже после 10 реиммунизаций кролики продуцировали моноспецифичные антитела против рассматриваемого белка. Это еще одно доказа- тельство высокой степени чистоты, и нативности ИП. . .д . .

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я

4 .

Способ очистки en-ингибитора протеи- .наз из плазмы крови человека с помо.щью металл-хелатной хроматографии, о т л и ч а- ю щ и и с я тем, что, с целью увеличения эффективности очистки, на первом этапе плазму крови подвергают аффинной хроматографии на голубой агарозе при рН 7,0, на втором этапе осуществляют .ковалентную хроматографию на органортутной агарозе в присутствии 0,1 % додецилсульфата натрия, 0,01 М трилона Б при рН 7,0, а затем медь (II) - хелатную хроматографию на иминодиуксуснокислой агарозе в присутствии 1 М хлористого натрия при рН 8,0.

Область использования: медицина, биология и может быть использовано в промышленном производстве белковых препаратов и медицинских диагностикумов. Сущность способа заключается в последовательном проведении аффинной хроматог- рафии на голубой агарозе, к.овалентной хроматографии-на органортутной агарозе и металл-хелатной хроматографии на имино- диуксуснокислой агарозе, находящейся в медной форме. Способ позволяет существенно повысить выход этого белка при его очистке, из плазмы крови доноров, а также сократить общую продолжительность биотехнологического цикла.