Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности, биотехнологии.
Целью изобретения является получение структур, обладающих иммуногенной активностью кор-антигена вируса гепатита В и белка др41 вируса иммунодефицита.
Цель достигается в результате конструирования рекомбинантного гена HBcAgHIV-gp41 (78-129), кодирующего синтез соответствующего белка, и плазмиды
pHIV41-22 для его экспрессии, а также штамма-продуцента Е. coli (pHlV41-22) pe- комбинантной капсидной структуры HBcAgHIV-gp41 (78-129).
Рекомбинантная плазмида ph IV41-22 состоит из следующих элементов:
ДНК плазмиды рНВс1615, которая представляет собой вариант плазмиды рНВсЗ, содержащей ген НВсАд с оптимизированным участком инициации трансляции, но с мутантным геном НВсАд, содержащим
полилинкерную вставку по 144-й аминокислоте и предназначенным для внедрения чужеродных последовательностей по этому участку.; протяженность 6900 п о,
фрагмента генома ВИЧ, клонированно- го в плазмиде рВНЮ и кодирующего уча- стокдр41 (78-129), протяженностью 157 п.о. Размеры плазмиды 7057 п.о., мол.м. 4,52 МДа.
Сущность способа конструирования плазмиды pH V41-22 состоит в том, что фрагмент гена env ВИЧ, именуемый HIVgp41 (78-129) протяженностью 154 п.о. внедряют по сайту рестрикции Cla I в векторную плазмиду рНВс1615с образовани- ем рекомбинантного гена HBcAg-H V-gp41 (78-129).
Штамм-продуцент HBcAg-HIVgp41 (78- 129) получают трансформацией клеток Е. coli RRI рекомбинантной плазмидной ДНК PHIV41-22.
Штамм характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки: клетки палочковидной формы, грамотрицательные.
Культуральные признаки: клетки растут на обычно используемых питательных средах, образуют колонии средней величины.
Физико-биохимические признаки: оптимальная температура культивирования 37°С, оптимум рН 7,0-7,4. В качестве источника углерода используют углеводы, в качестве источника азота - минеральные соли, а также органические соединения в виде пептона, триптона, аминокислот.
Устойчивость к антибиотикам:устойчив в ампициллину, что обусловлено наличием плазмиды. Присутствие в штамме плазмидной ДНК подтверждают путем проверки устойчивости к ампициллину, а также путем выделения и анализа пладмидных ДНК.
Продуктивность штамма-3,3% целевого продукта от суммарного белка Е. coli.
Штамм1 депонирован в коллекции Центрального музея п ромышленных микроорга- низмов под номером ВКПМ В-4972. Пример 1.
1. Конструирование рекомбинамтной плазмидной ДНК pHIV41-22.
2 мкг ДНК плазмиды рНВс1615 расщеп- ляют 4 ед. рестриктазы Cla i в 25 мкл раствора А, содержащего 10 мМ трис-HCI, рН 7,5, 50 мМ NaCI и 10 мМ MgCte, в течение 1 ч при 37°С. РестриКтазу инактмвируют 15-минутным прогреванием при 65°С. Заполнение липких концов проводят в 100 мкл раствора Б, содержащего 50 мМ трис-HCI, рН 7,5, 10 мМ MgCte, 10 мМ дитиотрейтол. 25 мМ NaCI. 100 мкМ dATP, dCTP, dTTP и dGTP и 5ед. ДНК-полимеразы Е. coll (фрагмент Кле-
нова), в течение 1 ч при 12°С. После очистки в агарозном геле ДНК растворяют в 20 мкл Н20(ДНК1).
20 мкг ДНК плазмиды pSS 3,8 несущей субклонированый фрагмент генома ВИЧ, расщепляют 50 ед. рестриктазы Bgl II в 100 мкл раствора В, содержащего 10 мМ трис- HCI, рН 7,5; 10 мМ MgCl2, с течение 2 ч при 37°С, наносят инкубационную смесь на 1 %- ный агарозный гель, выделяют фрагмент размером 1430 п.о., липкие концы заполняют, как указано выше (ДНК 2).
5 мкг ДНК 2 расщепляют 10 ед. Sau ЗА и 10 ед. Hlndlll в 20 мкл раствора А в течение
2ч при 37°С. Фрагмент Sau ЗА - Hlndlll выделяют на легкоплавкой агарозе (ДНК 3).
0,1 мкг ДНК 1 и 0,05 мкг ДНКЗ сшивают Т4 ДНК-лигазой в 10 мкл раствора С, содержащего 50 мМ трис-НС, рН 7,5; 10 мМ MgCl2, 10 мМ дитиотрейтол, 50 мкМ АТР и 10 ед. Т4 ДНК-лигазы, в течение 12 ч при 4°С. Для трансформации клеток к реакционной смеси добавляют 100 мкл клеток Е. coli RRI, обработанных хлористым кальцием.
Отбор клонов осуществляют путем ре- стрикционного анализа плазмидной ДНК. выделенной экспресс-методом, Плазмида с ожидаемой рестрикционной картой получает наименование pHIV41-22.
2. Штамм-продуцент Е. coll RRI (рН141- 22). Выделение и очистка рекомбинантного белка HBcAg-HIVgp41 (78-129).
Штамм-продуцент получают трансформацией клеток Е. coli RR1 рекомбинантной плазмидой рН1У41-22. Клетки выращивают в солевой среде М9 с добавкой, г/л: казами- новыс кислоты 10. глюкоза 2; ампициллин 0,02 до оптической плотности ОПезо 4-5, Клетки собирают центрифугированием и ли- зируют в трехкратном обьеме буфера, содержащего 0,05 М трис-HCI, рН 8,0; 0,15 М NaCI, 0,1% тритон Х-100, 0,005 М ЭДТА.
3мг/мл лизоцима. После инкубации в течение 30 мин при 4°С клетки подвергают трехкратному замораживанию - оттаиванию, добавляют дезоксирибонуклеазу и МдС1адо конечной концентрации 20 мкг/мл и 10 мМ соответственно и инкубируют 30 мин при 4°С. Лизат подвергают ультразвуковой обработке в течение 30 с, осветляют центрифугированием.
Лизат подвергают фракционированию сульфатом аммония. HBcAg-H gp41 (78- 129) собирают в осадке, полученном при 30% насыщения сульфатом аммония. Осадок растворяют в 0,04 М фосфате натрия, рН 8,0; 0,15 М NaCI, 0,1% тритоне Х-100 до конечной концентрации белка 25-50 мг/мл и 6-7 мл этого раствора наносят на колонну Ј Сефарозой CL 4В (2,1 х 75 см), уравновешейную тем же буфером, но без тритона Х-100, Фракции, проявляющие РВсАд - активность, собирают и используют либо непосредственно, либо после концентрирования переосаждением 50%-ным сульфатом аммония.
3.Определение НВсАд - активности методом РИД.
Титр НВсАд определяют с помощью радиальной иммунодиффузии (РИД), Для этого готовят двукратные серийные разведения клеточного лизата и титруют против анти-НВс антител человека, В качестве стандарта используют очищенный НВсАд, полученный из рекомбинантных бактерий (1 мг/мл). Результаты титрования методом РИД приведены в табл. 1.
4.Определение др41-активности методом иммуноблотинга. Мол.м. белка HBcAgHIV-gp41 (78-129). Для иммуноблотинга клетки (б мг) суспендируют в 100 мкл буфера для нанесения образцов на полиакриламидный гель, содержащего 2 %-ный додецилсульфат натрия (ДСН) и 2%-ный /3-меркаптоэтанол, и лизи- руют2 мин прогреванием на кипящей водяной бане. Полученные лизаты (2-4 мг/мл белка) наносят на полиакриламидный градиентный гель (12-18%) размером 150х 150х х 0,75 мм. Электрофорез проводят в течение 15 ч при силе тока 7 мА. После электрофореза белки переносят на нитро- целлюлозные фильтры, инкубируют с моно- клоиальными анти-др41 антителами 3D6 в разведении.1:500 на буфере TBS, содержащем 50 мМ трис-HCI, рН 7,8; 150 мМ NaCI, 0,1% тритон Х-100, 1% БСА, D течение 15 ч при 20°С. После трехкратной отмывки буфером TBS фильтры инкубируют 2 ч при 20°С с конъюгатом пероксидазы с антителами против иммуноглобулинов человека в разведении 1:16, Фильтры отмывают буфером TBS (3-5 раз) и проявляют дмаминобензи- дином. Лизаты клеток штамма-продуцента обнаруживают при этом появление специфических зон окраски, соответствующих- белку с мол.м. 25,5 кДа (или длиной 241 аминокислота). Контрольные лизаты клеток Е. coli K802 (рНВсЗ) таких зон не обнаруживают.
5.Анализ пространственной структуры рекомбинантного белка.
Препараты очищенного бел ка HBcAgH V-gp41 (78-429)(описано выше) готовят методом негативного контрастирования с применением 1 %-ного уранилацетата и наследуют на электронном микроскопе при ускоряющем напряжении 80 кВ и инструментальном увеличении 100 000 раз. Белок HBcAgH V-gp41 (78-129) образует кап- сиды диаметром 25 им.
Пример 2, Определение др41- активности в составе капсидных структур
5 HBcAg-gp41 (78-129) методом энзимоиммунологического анализа на твердой фазе.
В качестве твердой фазы используют
полистироловые 96-луночные планшеты для
иммунологических реакций. Очищенный бе0 лок HBcAg-HIVgp41 (78-129) разводят до
концентрации 10 мкг/мл в 50 мМ NaHCOaj
№2СОз, рН 9,5 и вносят в лунки планшетов
по 100 мкл в каждую. Инкубируют 16 ч при
37°С, после чего раствор удаляют из лунок,
5 планшеты высушивают, В лунки вносят мо- ыоклональные анти-др41 антитела человека в разведении 1:5000 на буфере TBS. После инкубации в течение 2 ч при 37°С планшеты отмывают 5-6 раз дистиллированной водой
0 и вносят по 10 мкл конъюгата пероксидазы хрена с белком S. aureus в разведении 1:5000 на- буфере TBS, После инкубации в течение 1 ч планшеты отмывают и проводят цветную реакцию, В лунки вносят по 100
5 мкл 0,25%-ного раствора ортофенилдиами- на 2HCI в 0,1 М цитрате натрия, рН 5,0; 0,02% Н20а, инкубируют 30 мин при 20°С, реакцию останавливают добавлением 100 мкл 0,1 H.HCI. Появление коричневой
0 окраски свидетельствует о наличии др41-ак- тивности, для количественной оценки активности измеряют оптмческукг плотность при 492 мм. Отсутствие реакции в отрицательном контроле (НВсАд) свидетельст5 вует о специфичности связывания
анти-др41 антител рекомбинантными капсидными структурами HBcAg-gp41 (78-129).
Пример 3. Определение др41-активности на поверхности капсидных структур
0 методом иммунноэлектронной микроскопии.
Капсиды HBcAg-HIVgp41 (78-129) сорбируют на никелевой сеточке, покрытой формваровой пленкой, в течение 15 мин,
5 Сеточку промывают 0,5 мл раствора PBS, содержащего 0,05% Твин 20 (PBS-Твин 20), и инкубируют 15 мин в 0,03 мл 0,1 %-ного раствора БСА в воде, промывают 0,5 мл PBS-Твин 20, инкубируют 15 мин в 0,03 мл
0 раствора моноклонзльных анти-др41 антител человека в разведении 1:10, промывают 0,5 мл PBS-Твин 20, инкубируют 20 мин в 0,03 мл антител (кролика) против иммуноглобулинов человека (в разведении 1:5), про5 мывают 0,5 мл PBS-Твин 20. Сеточку помещают на 1 ч в 0.03 мл раствора pA-AU, содержащего белок А, который конъюгиро- ван с частицами коллоидного золота диаметром 5-8 нм, промывают 0,5 мл PBS-Твин 20 и затем 1 мл Н.л Капсиды окрашивают
методом негативного констрастирования 0,15 мл 2%-ного уранилацетата Все операции выполняются при 20°С. В случае поверхностной локализации соответствующих эпитопов капсиды на электронной микрофотографии окружены венчиком частиц коллоидного золота. В качестве отрицательного контроля используют капсиды НВсАд, не несущие эпитоп др41 (78-129). Эти капсиды не образуют комплексов с коллоидным золотом. Не образуются комплексы также в отсутствие специфических антител.
Пример 4. Иммуногенная активность рекомбинантных капсидных структур.
Для определения иммуногенности ре- комбинантными капсидами НВсАд- HlVgp41 (78-129) иммунизируют кроликов. Для этого смешивают 2 мг антигена, растворенного в 1 мл физиологического раствора PBS, с 1,25 мл полного адъюванта Фрейнда и получают гомогенную эмульсию Антиген вводят подкожно. Инъекции антигена повторяют на 14-й и 21-й день и с 28-го дня начинают брать кровь. Специфичность антител определяют методом ИФА с использованием двух антигенов: НВсАд (для определения анти-НВс антител), (для определения анти-др41 антител). Титры антител на 28-й день иммунизации приведены в табл.2.
Таким образом, изобретение позволяет получить рекомбинантные капсидные структуры, обладающие бифункциональной активностью по кор-антигену вируса гепатита В и эпитопу белка др41 вируса иммунодефицита человека.
Формула изобретения
1. Рекомбинантная плазмидная ДНК рН141-22, кодирующая кор-антиген вируса гепатита В с экспонированным на его поверхности фрагментом белка др41 вируса иммунодефицита человека, размером 7057 п.о. и мол.м. 4,52 МДа, содержащая
1 - Cla I - фрагмент ДНК плазмиды рНВс1615, размером 6900 п.о.;
SauSA-Hlndlll - фрагмент плазмиды pSS 3,8, размером 157 п.о.;
уникальные сайты рестрикции с координатами.
Bam HI
Sph I
Sail
Nrul
Sna I
Afl III
О (начало координат) 191 276 599 1871
Afl III2098
Pst I3236
Sea I3471
Xba I5176,
генетические маркеры и регуляторные 5 участки:
ген Ыа, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, - координаты 2918-3778;
orl -точку начала репликации- координаты 2153-2159;
0 ген HBcAg-H Vgp41 (78-129), находящийся под контролем тандема промоторов Ptrp, - координаты 4905-4937 и 5015-5047.
2.Способ конструирования рекомби- нантной плазмидой ДНК pHIV41-22 кодиру5 ющей кор-антиген вируса гепатита В с экспонированным на его поверхности фрагментом белка др41 вируса иммунодефицита человека, заключающийся в расщеплении ДНК плазмиды pSS 3,8 рестриктазой Bgl И,
0 выделении фрагмента размером 1430 п.о.. гидролизе его рестриктазами Sau ЗА и Hlndlll, выделении фрагмента, содержащего часть генома вируса иммунодефицита человека, лигирйвании его с помощью
5 ДНК-лигазы с ДНК плазмиды рНВс1615, предварительно гидролизованной рестриктазой Cla I, трансформации лигазной смесью клеток Е. coll RR1, отборе с помощью рестриктного анализа клонов, несу0 щих плазмиду pHIV41-22.
3.Штамм бактерий Escherlchla coll ВКПМ В-4972 - продуцент кор-антигена вируса гепатита В с экспонированным на его
5 поверхности фрагментом белка др41 вируса иммунодефицита человека.
Таблица 1
Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности и биотехнологии. Целью изобретения является получение структур, обладающих иммуногенной активностью кор-антигена вируса гепатита В и белка др41 вируса иммунодефицита. Изобретение позволяет получить белковые капсидные структуры, представляющие собой кор-антиген вируса гепатита В с экспонированным на его поверхности зпитопом вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) НМдр41 (78-129) и обладающие иммунологической активностью как кор-антигена, так и белка др41. Синтез таких структур кодирует рекомбинамтная плазми- да pHIV41-22, которая содержит ген НВсАд с оптимизированным участком инициации трансляции и с полилинкерной вставкой по 144-й аминокислоте, где клонирован фрагмент последовательности между сайтами рестрикции ЗаиЗА и Hindll, и кодирующий участок др41 (78-129) протяженностью 154 п.о - фрагмент белка др41 с 78-й по 129-ю аминокислоту. Размер плазмиды 7057 п.о. Ген Ыа обеспечивает устойчивость к ампициллину. Ген HBcAg-HIV41 (78-129) находится под контролем тан дема промоторов Ptrp и обеспечивает синтез целевого продукта. Штамм-продуцент имеет выход конечного продукта 3,3% от суммарного белка Е. coli. 3 с.п. ф-лы, 2 табл. сл 41 сл ш Ю „«ъ о
Синтез HBcAg -HIVgp41 (78-129) в бактериях E.coll RRI, несущих рекомбинантную плазмиднуюДНКрН1У41-22
Таблица 2 Иммуногенность химерных капсид HBcAg-HIVg р41 (78-129)
