Изобретение отниситг;я ; o ,si:-:T ;ir- логии и может найти применение- н MFJ робиологической промышленносп- к ветеринарии, особенно iip;-i n;-b i::-:-icr т-и.кс , профилактике и терапии яаб э.еипнп;1 крупного рогатог о екота Бноусн сй ;им кемией,
Цель изобретения - со ; -л11-п птпм- ма дрожжей, содержащего pi: о бннл;г; - иую плазмидн та ДНК, котор;эч колирус : поверхностный антиген BLV и i:pH култ,- тивировании штамма обеспечивает синтез производного белка обон Чс-с J.V с высоким выходом.
И р и м е р 1 . К(5Н струиронл П{е рекомбипантной п.пазми.чы р -- 8 J, с;о- держагцей фрагмент ДНК с. нлсть,-;) I er;; белка оболочки.
Схема конструирования iii)c,ac i aiiнона на фиг,1,
5 мкг ДНК плазМ1-и- 1 1 penv 26,. c.or.ci-- жап вй фрагмент генома с гега-- и белко;) gp 51 и gp 30, 1 идролизу1от рссчрикгг- ЗОЙ Bgl 11 в высокосолево:- буфере; ;:(держащем 100 мМ NaCl, 50 ;r: -::.г-l:Cl рН 7,5, 10 мМ MgCb, 1 мМ ДТТ мк: РНКазы А в объеме 20 мкл при , ,;ноту гидролиза K OHTpojiHpyio г :}:и:Н.;-:;,:о форезом в агарозном геле, кэлучелны;; препараты обрабатьшают с ::oMi:) Клс- новского фрагмента полимера зы : в этом же буфере с добавле)иеь; чсль;-- рех дНТФ до конечной :о:г;Ц( иг.и 100 мкМ, используя 2 ел. ферме; ; а, Реакцию проводят при н течел -е 30 мин и инактипируют liporpc- ванием при. в течение 10 мин, Ие-- лученные с j-yiibiMVi лоипалнг использурот для п рисоепилсиич ;;, синтетических EcoR 5-ri;iHKt 1;:л: .jcvia- ва CCGAATTCGC. Для этс;го сгнчанл (ВОДЯТ фоСфОрИЛИрОВаНИС Ь( I :- OJ f ЛИК:
кера 3 буфере, содержание : 6 трис-НС рН 7,6, 10 мМ СЬ, 10 ч - ДТ 1 мМ слермидина. 20 ITMOJ;J, - - i ATi (1000 С/ммоль) 2 ед , гголмгп кнеоти киназы н 100 iкг/мл БСЛ, Релккил ripi; водят лри в течение 3(; ник ;i объеме 15 мкл. За-гем л;оба.чли;ит ..Ф до конечной концентрации I --sM.. i ег;, полинуклеотидкииазы и г-гнкубпруют еле 30 мин при 37°С, Включение не-гк в состав линкера контролируют с; обработки аликноты реакпиолной -:че:нт сорбированной на филь тре ДЕЗ буфером, содержащим МКа,,НРП,.
Меченый препарат линкера (20 лмол вносят в реакиионнуго смесь, еодйрЖ - :rv-r Kj - 1 1:э)агменть: ллазмилы penv 26 :; лог гр()1ми концлми, лобавл 1от ДТТ ;:: К( Ko-nicrirpa лии 10 мМ, лО-ДО ел, .,lil -: -ir;i-ibi iba: ;; Тч LI инку- чртунгг ;п 1 Л11И : ; С, i;r;e лигаз - ;п-ак ; лрогргипнием при 70(. п ;ече}пл iO мин л ;л аклионную смесь глпблкляют 11 3 ()косо:1евым бу- :: --pnf- , Доба1л:якг|- 20-30 ezi , реетрикта- - coR л имк;, б1 11уктт 3 ч при 37 С.
iio.rniCJTy jnfrHjjO;: алия и гидролиза :-естрикта ЗОЙ ко -полируот с iON:oi:tbio ::;лсктрофс;рй :г1 аг1ик;иу: реакционных сме : i i в 5А-м ПАЛ , Фрагм(л-1т л:1азмиа- р,ь; )пу 26 pa3MtipcM 1,25 ттп j содер- .с:.1чий укорочелный ем о,г 1 s колгуча- :;: нуте - ч.нчнши из 5/; -но:ч ПЛАТ .
Дриг;} : :)л пг : П-;С л змек тр(1форез ; po Ujj rr пи с г-аг.ларч л.1Й мет о/итке i . Аокат1изаии;с фра;нм1;нп 01 ДИК п геле ::;ч:. л- оконл;л:ИЛ злек / робореза опреде- ::1 Ч1 :;у гем г ь чл адио „ ,.1ялее вы- ;:(л;,10 ; из ке.ги :олсл:у, г vч: Фрагме1 ам ДНК размг ром ,224 л.о гтя ;)л;(1лли ; :у:-счек ч;ля размельчают - fn.-jKM-:v с:)лер:аа1..1ем 150 мМ NaCI, н; мД Р-г-;1|Д лНВ, ;0 мМ ЭДТА рП8 п об р.еме i v; ;; лпкуоируют 16 ч при Д Суслеля: ( Еля целтрифукируют лпл iOOOO on,/ми;: Q мин, сулерна т фильтру } через е-гекловату, ос-- .; r.) гром-лвают еще одним объе- ;л буфера,, лен i рифуглгругот. фиJ;ьтpy-- : -; объедипу О : лолУ теллые , - :л; oca) ( к г:олученньп- раст- -1Л.11м лобаи. лмот 1/20 обт.ема 2%-ного 1 е глора ле Т клтриметмламмонийброми- л ;;, : Г1лсЧ ;(:л колле}1 1 ралир - К /.:, (..1;-сь г, :: :) ла 30 ми}{ ллил; rii; :n f :.л; ./ -ллгуре i-r затег-i ,ол-:нл1|)уг ; ру-е-- ;0 :.;л1 при 0 ть;с. : / МИ1 . {,ул-K iir т,.}; ;;тб;5асл.1вают ; )i- р/ С л-еря-04 - ; 00 ЗМ але- : к:е /ллгрия р. ё, 6 , лоблзлякг;- 3 o6i5e (:л1;г:а ллрсл: о:-:ла ;рл-1от ч при -.P i.., за -е--- дчг р) ьи; у от iO Mtn-i Kpt: И; г ,, :-л-;л , Кп;1ученпый осадок р;ил HOj-Mii : м 100 (Д 3 Л ацета-:-а л i:e; }K;iaiO i ак сл ис:ар;о кыше .
е ;л1гго;- . 1л.е;лплл;п;с7 vi раетворяют 5 iO г-;к,л :Л), / мкл (л;аг мен .-а гидро - л зу;лт :л.-; ой : н средне- л:-лезом буфере ЗС м;1 NaCl ; 10 --.е-(С1 7,6; lO мД Mod. , I мМ Д ГГ лри 37(; F объеме 25 мкл, используя 3 еп, ф(р 1егг-л , Ог-разующиеся Фрагмелил луес г-: /;лги овалия
в состав вектора рАТ1125, содержащего терминатор транскрипции гена РН05
Вектор (полученный в лаборатории генетической инженерии растений I-IMB АН СССР) представляет собой плазмиду pBR322, в которую по сайтам EcoR 1 и Hind III встроен модифицированный путем клонирования фрагмент размером 380 пн, содержащий 3 -концевую часть гена РН05.
После расщепления ДНК 5 мкг вектора рАТ1125 совместно рестриктазами EcoR 1 и ХМА 1 в стандартных условиях большой фрагмент размером 4,8 тпн выделяют из препаративного ПААГ, осадок ДНК после злюции растворяют в 20 мкл воды и используют для клонирования.
Реакционная смесь содержит О, мк вектора; 0,5 мкг фрагментов, 50 мМ грис-НС1 рН 7,5; 10 мМ MgCl ; 10 мМ ДТТ, 5 ед. ДИК-лигазы фага Т4; мМ АТФ; 100 мкг/мл БСА в объеме 40 мкл. Лигирование проводят в течение ночи при 4 С. Для оценки эффективности встраивания фрагмента в вектор в качестве контроля проводят Лигирование 0,1 мкг вектора в тех же условиях без фрагмента.
Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки штамма E.coli НВ1 О, полученные методом обработки CaCl.
Клетки реципиентного штамма E.coli НВ101 растят ночь на качалке в 5 мл УТ-среды при 37°С. Ночной культурой (0,1 мл) заражают 100 мл УТ- среды. Инокулят подращивают до плотности клеток в среде 0,6 о.е. при 550 нм и центрифугируют при 7000 об./мин, , 10 мин. Осадок переносят в ледяную баню (все последующие операции про
водят при 0°С) и суспендируют в 50 мл стерильного холодного раствора: 0,05 М ТРИС -НС1, рН 8,0; 0,05 М CaClJ. Через 20 мин клетки осаждают, как описано вьше, и суспендируют в 5 t-m приведенного раствора. Через 30 мин инкубации в ледяной бане реципиентные клетки считаются подготовленными к трансформации их плазмидной ДНК.
К 0,2 мл суспензии клеток (в стеклянных силиконизированных пробирках) добавляют 0,075 мл смеси лигирован- ных молекул в расчете 0,5-1,0 мкг ДНК на 8-10 клеток. После последо
0
5
0
0
5
0
5
Q
вательной инкубации полученной смеси в течение 25 мин в ледяной бане, 2 мин в горячей (42°С) и 10 мин при комнатной температуре в пробирку добавляют 2 мл УТ-среды и подращивают культуру на качалке при 37 С.
Трансформанты выращивают на чаш- клх Петри, содержащих 50 мг/л ампициллина в течение ночи при 37 С. 12 случайно выбранных колоний трансформантов выращивают в 5 мл среды УТ с ампициллином и выделяют плаз- мидную ДНК. Культуры клонов выращивают в -пробирках в течение ночи. Клетки осаждают центрифугированием при 10000 об./мин в течение 5 мин и тщательно суспендируют в 0,1 мл раствора 1 (0,025 М трис-HCl, рН 8,0, 0,01 М ЭДТА; 0,05 М глюкоза), в которой добавляют лизоцим до концентрации 2 мг/мл. После выдерживания суспензией в течение 30 мин в ледяной бане к ним добавляют по 0,2 мл раст- 5 вора П (0,2 н NaOH; 1% SDS), а после осторожного перемещивания и выдерживания еще в течение 5 мин при О °С - 0,15 мл раствора III (3 М ацетат натрия,. рН 4,8). Вязкие смеси слег ка взбалтывают, инкубируют 1 ч в ледяной бане, а затем центрифугируют 15 мин при 10000 об./мин. К 0,4 мл суперна- танта, перенесенного в новую пробирку, добавляют по 1 мл 98%-ного спирта, смеси охлаждают 10 мин при -70 С и центрифугируют 10 мин при 10000 об./мин. Осадки растворяют в 0,1 мл 0,3 М ацетата натрия, к растворам добавляют по 0,3 мл спирта, смеси охлаждают и центрифугируют как описано выше. Осадки промывают спиртом, сушат и растворяют в 20 мкл Н20. Аликвоты растворов ДНК анализируют электрофорезом в агарозньк и полиак- риламидных гелях до и после гидролиза ДНК эндонуклеазами рестрикции. Гидролиз 0,5-1,0 мкг ДНК проводят 0,5-1,0 кд.фермента в 10-20 мкл инкубационной смеси в течение 1-2 ч. Плазмидную ДНК рекомбинантных кло- нов анализируют с помощью рестрик- ционного расщепления эндонуклеазами Вам HI и Pst 1 (в высокосолевом буфере в стандартных условиях). Клоны, содержащие фермент гена gp 51 в векторе рАТП25 в правильной ориентации по отношению к терминатору транскрипции гена РН05 образуют по два фрагмента при расщеплении плазмидно
ДНК рестрикт;пой 1 ;1м {1 (А. i и./ii.ii.,;.,- :м . :-|-ii г. ni o; ii:i: : ir: i;i1,22 тпо) н Pst : (3.6 т I,S : :.:,- i;-; : TI миг ыс . i l .., : ;:. Шлис
что дока з1ииаот(;я :);(-к Г)о;||, r;i;,: 1- ;;н ч;1 п.;-|мгрО -- , 7 MMI, . ч v-rriiii- ро- иза-1х)н гита ями;и101 ЛНК - :,;;ч1| : .: п.пчш i-i , if:l- IM г;:)м i :,2 и 0, m;i
ге:ге .- ;IH ; ;;ч .ч;гч чт:; :П, - , :; + - ; , 3 -
Пример 2. а. Н;лтруи:5опч ifi ,П - , -;-4ii :;i4: гчлрч. рекомбинантнс й гигл зми;; (i44.: ч- 1 - Ммк: I , :S., 3 + i , fS :-ч.ч ч;)1:
ZUl я KOnCTpyHpOIiaSilU рем. Г- Г И1 Ч;-ч-ч . ;);; - тч: т ; Ч-ЧЙ S 1 б,
И(1Й Г лаямиды, duiitxioroH на
сиитея прои питлиого Гчччкп iiOca ч Мч ;i-:
BGL li к гс Т ках дрожжей, и Ч )(. пч- чч
функционалыилги . ,,41чч н
фрагмент ДНК, п.чазмилм pS( --83 чччч--:
частью репа рр 51 и :-Г р:ч1 11-г;чм : -: чтранск}5ИГ1ЦН1-1 т ена НО и ф;);); -.-чп ч ;ч1
ПЛаЗМИД. рА1 5- ., И(ЧЛУЧ{ ; Н: М1 I-: Ч-ЧЧСЧ --Г
торин рснетической (ппччиечгп; р чтч-i ч
НИИ №1Б АН СССР, (М1жа:111 ;1 ир-чнч чччч
транскрипции рсиа РПОЗ и ЧГ1Ч :1с,1.чп - а чтедьнс1СТ1 сли ил.ль 1г(5г о iKMi ида,: lli; i- i ii
мотор -ый фраг мемт рриа РН.; и jx4-ic i а -i
ляет собой Ва HI - РчоК i |;рч: .ччпii i
э гого гелга размр)ом oC d ;:о, к 1.1чт Ч1ч:-i
му по сайту Г{,ча I npfi4Op;u:f i4Jin могч-ч-,i
довательность СТЛСАЛТТ, гсччто.ччис ч
НУКЛеОТИДОи КОТ;1р(Й ППеД.Г ТЧЧ 1;лЯ: -- ч L4--1
бой участок paca:te:i:ieni4K г, гкч )П1-ч--1
тазы Рдч)К 1 .
Схема кгэнструироваиия чччч::И-ч ча-i
УЕрЗСЭ приведена на с|:кг.2. :П хк:
ДНК плазмиды pSC;-83 pacaiei-r,-: яю чiIi
стандартных реет ч : :;га- а ч;i
EcoR I и Hind TLT, фрагмр п Л -ч г- ч-
МРром 10/0 по И1.:деляют р:з пп.:.г:Г:рп а ; -i i
него ПААГ как огл1сано п FFI HNK- PC I ,мif
Из плазмиды рАРЗ апячюпр ным ччра-1i i i
rjOM В рделяют Bain HI - Ec oR I ф) П мгч -i i i i
размером 600 no.I
10 МКГ 1:лазг-1и;11 ой . ч:К чл-К /срч
YEpl3, гидролизо1 ал1п J4 i р;ч(г рл ч; a зч -i
мн Bam HI и Hind Д I т; ) t
условиях, разделяют э.лек rjio i)i)pi 4U f-:ii
в 1 %-HOM агарозиом ге.ле и ф:;арчч| Ч;
ДНК размером 10.3 тли пычюччю хакм ti ольчс;; аобычно npiniHTO. t
Лигироиалие иектормс -о Ва::; Д иi ii ,3 Hind III фрагмеггга с дпугая члр лаччч-i
мыми фpaг eнтaми Ззт 1- I - F.uoPv ini пiо ;ч ч1 - EcoR 1 - Hind III пронэдят клк ом --Л1 i и - PD
сано в примере 1 с: i-tcri эльчочанир ri . я л
О, мк Р вектора, и по 3,5 : -г; г i1ра ;илзментоп с различающимися ЛИГПСТР-И i i iipo i-T cцами. Дигазной сГ 1еср)Ю i pauci юрмлру -,... 1.5 .-. . .-, .,- «...i -i,.; , Зчечм;и
ют KOMFieTeHTHijie клетки пл ам/ а : . г,ч Ч Ч-чкдаю в ч-гари,,;р,;; ччаканах НВ 101 , Отбира11 транс1111:)рмаг-г: ы с ilic ю-ч: млн при 3000 (ч 1, и ipoNp-niaioтипом rirfl- -jVt :n-t-TET-. ДНК и :1ро; з оль-ч ччштль;;ым ТЕ Оу:Ьсро:ч iO мМ 7г.
но выбранных 12 клопов зь;д1ч1Я10 ; чч-;Ч|
моп;ып метг)да щелочног пкс -| г1 jnii i , )
исходног о объема к буфере, содерж.г- шем О,1 1 LiCl. Инкубируют 1 ч при 30°С, ncicjie центрифугнролания огадок клеток суспендируют я том же буфере в концентрации 3 х 10 клеток/мин,
К 200 мл суспензии клеток прибавляют 20 мкг плазмидной ДНК YEpSG94 и 400 мкл 50% раствора П.Э.Г. 4000, выдерживают 1 ч при 30 мин. После инкубируют 5 мин при 42 С. Суспензию осаждают центрифугированием 10 с при 10 тыс. об./мин. Осадок суспендируют в 300 мкл поды и высевают но 100 -.мкл на чашки с твердой селективной средой (0,67% дрожжевых азотистых оснований, 2% глюкозь, 20 млг/л гистидина, 2% бактоагара).
Колонии трансформантов появляются -4 день после посевов. Митотина
ческую стабил1 ность цлазмиды YEpSG94 в трансформантах определяют как процент клеток, сохранивших плазмиду при росте в селективных условиях на минимальной среде без лейцина. Отобранные индивидуал тные колонии псрвич- трансформантов переносят штрихом на селективную среду, и после роста клеток при 30 С в течение 12-20 ч культуру клонируют на полной среде YPO. Выросц ие на полной среде индивидуальные клонь затем повторно переносят на минимальною среду для определения процента клонов, сохранивших прототрофность по лейцику,
Определенная таким образом мито- тическая стабильность плазмиды YEpSG94 в штамме АН216 состав.ляет 75-85% (среднее из 10 определеии ) .
Плазмидную ДНК из трансформантон штамма ;Ш 216. выделяют след пощим способом .Клетки, выращенные в 200 NLT минимальной среды без лейцина,центрифугируют и тщательно промьшают водой. Промытые клетки инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин в следующем буфере : 0,64 М мерканто- этанол-+ 0,1 И трис +0,1 М ЭДТА (8,0).
Затем клетки центрифугируют и многократно промывают буфером, состоящим из: 0,126 М Na.J-lPO + 0,56 М (NHp.SO 0,062 М цитрат, и ресус- пеидируют в этом же буфере. Далее следует 1-часоная инкубация в присутствии 10 mg Zymolase 5 -10° клеток при 30 С, Протопласты собирают после центрифугирования, промьшают двагкды
10
15
-. -
20
30
35
45
50
55
08
в 1 М ссф итоле и ; ()б1н5ме 5 мл сор-- бИтола вь:дс:1яют ДНК,
Полученной плазмидной ДПК трансформируют клетки E.coli HBlOi. Из тех же тра}1Сформлнтов, которые выросли на среде YT с ампищ плином, выделяют плазмидную Д1П(, расщепляют при 1омощи ферментов рестрикции EcoR 1 - Hind III, Bam Н и Sal 61 и после разделения цродуктов расщепления в 1%-ном агарозном геле доказывают структурную стабильность плазмяды, вььтсленной из дрожжей. Полученный штамм, - продуцент производного белка оболочки BLV депонирован во Всесоюзной коллекг;ии Мшчроорганизмов ИБФМ АН СССР под № СЯ280Д характеризуется следующими признака И:
Морфолог ические признаки: вытяну- гие , па.лочковидные, грам-отрицатель- ные, неспорулируюпп е клетки,
Культуральные признаки: клетки хорошо растут на обычно используемых питательных средах. 1а 1 ,5%-ном питательном агаре Дифко образуются гладкие серые, блестящие круглые с ровным к-рае колонии. При выращива- НИ1; в жидких Т- и LB-средах возникает тгнтенсг.вная мутность,
Физиолого-биологические признаки: оптимальная температура культив-иро- вания , рН 6,8 - 7,5. В качестве источника углерода можно использовать углеводы, орга- Н1 ческие кислоты, спирты. Источником азота служат минеральные соли (в аммонийной или нитратной форме), органические соединения (в вт-ше пептона, триптона, а -гн нокцслот) ,
Устойчивость к антибиотикам: про- устойчивость к амгшциллину (50 мкл/мл),
Все DJTdMMb дрожжей, несущие плаэ- миду YEpSCT94, характеризуется щими признаками.
Морфологические признаки: клетки имеют форму от круглой до овальной, при делении почкующиеся,
Культуральные признаки: клетки хорощо растут на используемых питательных средах. На 2-2,5%-ном питательном агаре Дифко образуются гладкие, белые колонии с ровными краями. При выращивании на жидких YEPO и YNB-средах появляется интенсивная ровная мутность,
Физиолого-биохимические признаки: огггимальная температура культивнрования 28 - 30, оптимум pil Ь,6. В качестве нсто гннка углерод; , с;1ужи главным образом глюкоза, ; некото 1ы ; случаях спирты. Источником ачота rjr- жит (ЫН) орга 1И еск;|:е соехшис ния (в пептона, аминокиг;10-1-) .
П р и м е р 5. Тест ирозйние экспрессии производного белка обо::с чки BLV в лизате и1тамма продуг;,,
Для тестирования экспрессия пр;)- изводпого gp 51 п трансфо1эмирован1;оу штамме АН216 однонремепно я при ,оли- наковых условиях выращивагс-т к, трансформантов и свободный эт ii;:a: - миды штамм реципиег та в 1 мт гс чпой к ул ь ту ры , и flip а щр н н о и в с е л е к и к н о f- среде с 1,5 г/л K-Pi, впод,я г в 1 ()() ь. полной среды без фосфата, 50 г дрожжевого экстракта ,.Цифкс1 М, 100 i бактопептона растворяют н Li водь; до конечной конпептраг;ии 0., 3ч . К полученному раствору добавлTIIJT чр перемешивании до TOSS же конечной кондентрании. Поспе : .--часов(1- го перемешивания ггрн ко) ратуре раствор фильтруют и Ярлбат-:- вают Н( 1 , доводя рН до 6. Добавляют 3 М адетата натрия (рИ 6) ;(о коночной концентрации -l и рлс 1 B..ip i; токлавируют, Полученный rioi; ie п | .,)ги раствор ра - б чнляк т vi 5 раз и до()я,ч.1Я ют глюкозы до конечной к онгим: трплт г 2%. Такая среда .исноль- уетс;: лп;-1
КуЛР.ТИНИрОВаНИЯ ДрОЖЖС и V( .ПОНИЯХ
деренрсссии промотора I en;; MO-j , Ilap.TjijiejibHO Bi ipauu-iB;uoT I ( О -ui трансформационной кул) гурь: т фосфач- содержшдей миь имг .тьной дс (f),i) : YNB 2% клюкоза + 20 nig/L i нстгди--- на) . Г1(1сле 28-ча( . нии iiiiii 11(;:лучают 3 riajjaj jii jn Mi.iM культур ( це1Г рифуги рО1 а;;ин} , нромываю 1 их нодой и ис . или по1гучения протеиново гсз .чизата, Л.чя этого к O CaziKy добавляю - дне обтсм;. следую1п.{-г о буфера: О , ; i М N;:C ; , 30 мМ NaP; (рН 7,2) ; i NtM r-lSl- и равный обт.ем стеклянных inaprKoi {,д1:а метр от 0,45 до 0,5 мм), тпе (ic .чт-чи перемешиваю на миксере (.з мин) ( периодическим охлаждением в педян(Ч: бане, лизаты :д{ч1 грифугирую, ;то п; и вод1гг к от/;е. клет 1чно1 о лс б гц- са и стеклянн гх ujajJHKOB , Сулернатаг: очищают повтор}1ым центрифугированием в центрифуге Эпнендорфф,
Белок 5 который является производным gp 51, определяют в лизагах ме740810
: )дом 1ти-рдофаз11о: ) РИА. Кондентра- ччя Г1роиз юдиогч g;,) 51 в ;н1зате штамсми промотора ггчта PfH}5. составляет MJ кг/5 мкг белка, что соот- в.ггс тнует 0,27-. от общего рас 1 воримо- 141 белка Kj;eT: 4i,
Т р и ---I С: : 6 . Определс ние молекуT t-x iji i aMMO -; . вь ра денньгх как описано н г римере 5. разделяю г eтoдo диск- iiirx К фореза в ) 3%-ном ПЛАТ. Подниж, мо( -:ч. белков в i-еле к(Л тpOJпфyют по- . :ож Ч1И1 м ь:ат)1 серов . Од}1у но:1овину ге;;н оч);нпия;лпт, а по.лови}1у не гт; лгч у10 г Д.ЧЯ ;: : pi:4iC5c;; на нитродел- .: ),(й фи;1;-тр. nt Ciie переноса
--, гич . гр o6 i;i6;-: h/Bc)K) : антителами иро- :ч ВЛ и ме-:еным J бе.яком А, как ;. в iipMh e)e . чоднергакп ан- I Ч1 ;д1 огра })ин,
Aii;r :H3 ав :чч )ади Л рафии показал,
) -Т;; леч (м-;тиру емая ryi-ем гибра;хиз;и1ии / ,;; т;г1 и б : лкoм Л бе:гковая зо - , .гк)ги ;на я gj-) 5 I , присутствует : чч1.ч(1 в зк ранге, полученном из ма И ч; АН 2 1 о/ YEpS(i94 5 пыраишнном в
Vi 4on)ix деренрег с ИИ . ()::редел(;нный
:;vT: -.i ( 1 ОД В ИЖН О ЭТОЙ ЗО -
нь: ; Л: :(жеия1 ч маркертплх белков мо- ,-. к чяон|; Й I f чксчтрессии 1-: ч-; И5чяе 25 лЛ , ч го (чч тветству ет чч p-ic-pv белк :;)() в 230 аминоЗыиед(лч1Ь1ч чч нук.чечтидной 1кк:ле- ;ч;н/чгс:ч iitiot: тч фрагмента ., содер- .-..:Чл чч я в чча ч.щдс- Y pSG94, размер ; Ч чдвсчч п-Ч г рЗ, (лиггечируе- ч.ч Г члегьах , - oc-iaBjiHeT . А 1 ,
Л диноК1 Чи:тн;;Я :44:;j4.4i,oВ;г: ел ьнОС Т Ь ч чччп )) 1)Н(ич,) рсчич о бе;:ка :, ,/. V П1 :исчч1 т 268 ;1М1 нокис: От, Уве- ч1 ччние молек V ЛЯ11НО о иеса белка ;(. 3: ;:о г ;1;1вче;; -1н (чкидас мьгм гтроис- ч. Ч Г з;; чче : чли1С1:зич ирования .
MpOH i i ;):1ЧЬ1Й Т ГОЛ:/-Ч; gp 5, СИНТр, чг :чемы 3 кл: :-кчх , не явля- -ч г.пп озил;1|Ч1;ч 1ИГ1;Т.:ч Ч- тем не -Ч; ч Ч охраняет г ; новные антигенные
Ч : ( рМИЧаиТ gp Э J ,
41 J г, i у ; п и 3 о б р е т е н и я
:„ Рекомбинан1ная нлазмидная ДНК Yt iSf-94j коди(У)Тощая синтез произвол- :чч ч белка оболочки вируса лейкоза
крупного рогатого скота, размером 11,9 тпо, состоит из следующих элементов :
-большого Ват HI - Hind III фрагмента векторной плазмиды YEpl3 размером 10,3 тпо;
-Хта 1 - Hind III фрагмента реконструированной З -концевой части гена кислой фосфатазы дрожжей, размером 0,38 тпо, несущего сигналы терминации транскрипции;
-EcoR 1 - Xma фрагмента модифицированного гена гликопротерада
gp 51 BLV, размером 0,63 тпо;
-Ват HI - EcoR 1 фрагмента реконструированного промотора гена кислой фосфатазы дрожжей, включающего последовательность сигнального пептида, размером 0,6 тпо; содержит:
-1 участок расщепления рестрик- тазы Hind III;
-2 участка для рестриктазы Хта расположенных на расстоянии 0,380
и 6 тпо по часовой стрелке от единсвенного Hind III сайта;
-2 участка для рестриктазы Вага Н, расположенных на расстоя 1ии ,07 и 1,67 тпо по часовой стрелке от Hind III сайта;
-2 участка для рестриктазы
Sal 61, расположенных на расстоянии 2 тпо и 7 тпо по часовой стрелке от Hind III сайта;
-Ыа-ген, обеспечивающий синтез /3-лактамазы (устойчивость к ампициллину) , расположенной в участке от 3070 до 3930 пар оснований вправо
от Hind III сайта;
-leu-2-ген, обеспечивающий про- тотрофность по лейцину дрожжевого штамма - продуцента.
2. Способ конструирования реком- бинантной плазмидной ДНК YEpSG94,
30
37408. 12
обеспечивающий синтез производного белка оболочки BLV ггод контролем дрожжевого промотора, включающий выделение фрагмента, кодирующего часть последовательности гена gp 51 BLV, содержащегося в плазмиде penv 26, обработку фрагмента ДНК-полимеразой 1 (фрагмент Кленова), присоединение
10 к полученному фрагменту Ьинтетичес- ких EcoR 1-линкеров, расщепление фрагмента по внутреннему сайту Хт 1, введение с помощью ДНК-лигазы полученных фрагментов в векторную ДНК
15 pATl 1-25 по сайтам EcoR 1 - Xma 1, трансформацию рекомбинантными ДНК штаммов E.coli, отбор клона плазмидной ДНК pSG83, содержащей последовательности гена gp 51 в правильной
20 ориентации по отношению к терминатору транскрипции гена РН05 дрожжей, введение EcoR 1 - Hind III фрагмента плазмиды pSG83, содержащего часть гена gp 51 и терминатор транскрипции
25 гена РН05, и Ват HI - EcoR I фрагмента плазмиды рА53, содержащего промо- торную область гена РН05 дрожжей и последовательность сигнального пептида, в рекомб1шантну10 ДНК бифункционального вектора YEpB, расщепленного по сайтам Ват HI - Hind III, трансформацию рекомбинантными ДНК штамма E.coli, отбор клона, содержащего модифицированный фрагмент гена gp 51 BLV в составе бифункционального вектора, окруженный сигналами инициации терминации транскрипции гена РН05 дрожжей, ос тдествляемый с помощью рестрикционного анализа.
35
3. Штамм дрожл ей Saccharomyces cerevisiae М216 YEpSG94 ВКМ CR № 280Д - продуцент производного белка оболочки вируса лайкоза крупного рогатого скота.
Фиг I
PS f
X
-335.
. Z
p Фиг 3
Редактор М.Товтин
Произволе: тнени(:)-по;1ИГ-ча:})ИЧ|.:Г Ki)i
,4, ГГМ
Изобретение относится к биотехнологии и, в частности, к генетической инженерии. Изобретение может найти применение в микробиологической промышленности и ветеринарии, особенно при диагностике, профилактике и терапии заболеваний крупного рогатого скота вирусной лейкемией, Пелью изобретения является получение реком- бинантной плазмидной ДНК YEpSG94, обуславливающей синтез производного белка оболочки вируса лейкоза крупного рогатого скота, способа конструирования данной рекомбинантной плазмидной ДНК и штамма Saccharomy- ces cerevisial АН 216 - ВКМ CR279D (Всесоюзная коллекция микроорганизмов) , содержащего эту рекомбинатную плазмиду, - продуцента производного белка оболочки вируса лейкоза крупного рогатого скота, 3 ил.. t (Л оо со NU
