Способ обнаружения вирусов Советский патент 1992 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к вирусологии, и может-быть использовано для тестирования вируссо- держащих полуфабрикатов и вирусных препаратов.

Для анализа вируссосодержащих материалов применяют различные методы, в частности метод иммуноэлектронной микроскопии (ИЭМ).

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ обнаружения вирусов, включающий инкубацию вируссодержащей суспензии с кроличьей специфической имунной сывороткой в течение 30-60 мин при 37°С с последующей инкубацией этой смеси в течение 12-18 ч (второй этап инкубации) при 4°С. Затем эту суспензию центрифугируют при 12000 - 15000 хд в течение 60-90 мин. Осадок ресуспендируют е 0,05-0,1 мл 1-3%-но- го раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты (рН 6,8-7,2) и наносят на сетку с пленкой-подложкой из формвара, укрепленной углеродом. Приготовленные препараты

исследуют с помощью электронного микроскопа

Недостатком известного способа является его относительно низкая чувствительность.

Цель изобретения - повышение чувствительности способа

Способ осуществляют следующим образом.

В вируссодержащую суспензию, взятую в объеме 0,8 мл, вносят желточные антитела в количестве 0,2 мл (в разведении 1:400). Желточные антитела против вируса полиомиелита (ВПМ) вакционного штамма Себи- на типа 1 изготовлены в ИПВЭ АМН СССР По аналогичной технологии готовили антитела против ротавирусов обезьян (РВ) штамма SA-11 в лаборатории электронной микроскопии и патоморфологии названного института путем иммунизации кур вирусными антигенами с последующим выделением антител из желтков яиц. Титры антител перед исследованием определяют иммуноел

С

п - та8

х| СП

О х|

(етпяя

ферментным методом и отбирают препараты с титром не ниже 1 10 000

После внесения в вируссодержащую суспензию (исследуемую пробу) антител ее подвергают обработке ультразвуком с частотой 22-44 кГц в течение 30-45 с однократно. Затем суспензию инкубируют при 37°С в течение 30-60 мин (1-й этап инкубации), добавляют к ней 50%-ный раствор пояиэти- ленгликоля (ПЭГ) до его конечной концентрации 1-3% и повторно инкубируют при 4°С в течение 12-18 ч (2-й этап инкубации) По окончании инкубации суспензию центрифугируют при 12000 -15000 хд в течение 60-90 мин, осадок ресуспендируют в 1-3%-ном растворе фосфорно-вольфрамовой кислоты (ФВК) рН 6,8-7,2 и наносят на сетку с пленкой-подложкой из формвара, укрепленной углеродом. Приготовленный таким образом препарат исследуют с помощью электронного микроскопа.

П р и м е р 1. К 0,8 мл суспензии ВПМ с титром 4,0 Log БОЕ/мл добавляют 0,2 мл специфических желточных антител (в разве- дении 1:400). Затем эту суспензию обрабатывают ультразвуком с частотой 22кГц в течение 30 с однократно и инкубируют ее при 37°С в течение 30 мин, после чего к суспензии добавляют ПЭГ-6000 до его ко- нечной концентрации 1 % и повторно инкубируют при 4°С в течение 18 ч, Затем суспензию центрифугируют при 12000 хд в течение 60 мин, а осадок ресуспендируют в 1%-ной ФВК рН 6,8 и наносят на сетку с пленкой-подложкой из формвара, укрепленной углеродом. Препарат исследуют с помощью электронного микроскопа. В исследуемой пробе было определено 10Ь вирусных частиц/мл.

П р и м е р 2. Количество вирусных частиц в суспензии, содержащей ВПМ. определяют аналогично примеру 1 за исклю10 5 вирусных

чением того, что суспензию вируса после добавления к ней антител обрабатывают ультразвуком с частотой 44 кГц в течение 45 с, а после второго этапа инкубации добавляют ПЭ Г-6000 до конечной концентрации 3 % В исследуемой пробе было обнаружено 105 чайтиц/мл

П р и м е р 3. Количество вирусных частиц в суспензии, содержащей РВ с исходным титром 10 ТЦДбо/мл, определяют как описано в примере 1 В исследуемой пробе было найдено частиц/мл

По сравнению с прототипом чувствительность предлагаемого способа обнаружения вирусов возрастает в 10-15 раз Так, минимальная концентрация вирусных частиц, выявляемая по прототипу, в случае ВПМ составила до 10 вирусных частиц/мл а пои использовании предлагаемого способа - 10 вирусных частиц/мл; в случае РВ обезьян соответственно по прототипу - до 106вирусных частиц/мл, а с использованием предлагаемого способа - до 10 вирусных частиц/мл.

Формула изобретения

Способ обнаружения вирусов, включающий добавление к вируссодержащей суспензии специфических антител, двух- этапную инкубацию, центрифугирование и электронно-микроскопическое исследование ресуспендированного осадка отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, из антител используют желточные антитела, перед первым этапом инкубации суспензию с антителами обрабатывают ультразвуком с частотой 22-44 кГц в течение 30-45 с. а перед вторым этапом инкубации в суспензию вносят полиэтиленгликоль в концентрации 1-3%.

Использование биотехнология, вирусология, способы обнаружения и тестирования вирусов Сущность изобретения к ви- руссодержащей пробе добавляют желточные антитела, которые затем обрабатывают ультразвуком с частотой 22-44 кГц в течение 30-45 с. Затем пробу инкубируют в течение 30-60 мин при 37°С, после чего к ней добавляют полиэтиленгликоль до конечной концентрации 1-3% и инкубируют в течение 12-18 ч при 4°С с последующим центрифугированием и электронно-микроскопическим исследованием осадка По сравнению с известным способом чувствительность увеличивается в 10-15 раз