СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА Российский патент 2009 года по МПК G01N33/531 

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к вирусологии, и может быть использовано при производстве диагностических препаратов и для повышения эффективности серологической диагностики вирусных инфекций, в частности клещевого энцефалита (КЭ).

Известен способ получения диагностикума КЭ, отличающийся тем, что с целью повышения специфической активности диагностикума, используют авидный штамм вируса КЭ 4072, а для инактивации вируса к полученной вируссодержащей суспензии добавляют бетапропиолактон до 0,1%-ной концентрации и выдерживают в течение 24 ч при температуре 4°С, а после центрифугирования инактивация продолжается еще в течение 3-х суток (см. А.с. № 1378112 А1, А61К 39/12, G01N 33/53, 1987 /Кокорев B.C., Мансуров П.Г., Злобин В.И., Субботина Л.С., Гайдамович С.Я., Мельникова Е.Э./ Заявка № 4044449/28-13, от 11.02.1986).

Недостатком такого способа получения антигена является включение в технологический процесс высокоактивного химического реагента бетапропиолактона, отрицательно влияющего при инактивации инфекционной активности на антигенные детерминанты вируса. В связи с этим качество антигенных препаратов, даже при использовании авидных вариантов вируса, снижается.

Известен также способ, заключающийся в том, что в качестве источника антигена вируса КЭ используют авидные варианты вируса - штаммы 4072 или 3745, а инактивацию инфекционной активности осуществляют метилглиоксалем в концентрации 0,1-0,05% при 4-8°С в течение 24-72 часов (см. А.с. №1169219 А, А61К 39/12, C12R 1/91, 1985 /Гизатуллина Н.К., Равилов А.Э., Колотвинов С.В., Кокорев B.C./ Заявка № 3509839/28-13, от 05.11.1982).

Недостаток такого способа аналогичен изложенному выше. К тому же и в том, и в другом случае увеличивается время получения антигенного препарата и затраты на его производство при недостаточно высокой эффективности и чувствительности препаратов.

Известен и способ получения вакцины, при производстве которой инактивацию вируса в культуральной жидкости проводят облучением, при этом в качестве источника гамма-излучателя используют кобальт-60 в дозе 15-20 кГр в течение 2 ч при температуре 19-21°С (См. Патент РФ № 2181295, А61К 39/12, 39/245. Опубл. 20.04.2002. Бюл. № 11).

Основным недостатком такого способа являются особые условия обработки, требующие радиационной защиты и специально обученного высококвалифицированного персонала.

Известен также способ повышения антигенности и иммуногенности биоматериала путем воздействия на него излучением лазера длиной волны от 9 до 11 мкм и плотностью мощности 0,1-1,0 кВт/см², проводимым на струю суспензии биоматериала диаметром 0,5-15 мм, при скорости истечении струи от 0,05 м/с до 10 м/с (см. Патент РФ № 2209085, А61К 41/00, 39/00. Опубл. 27.07.2003. Бюл. № 21).

При хороших результатах такой обработки некоторой сложностью процесса обработки лазером является потребность в лазерных установках, требующих специальных помещений и дополнительных мер защиты обслуживающего персонала, что повышает затраты на получение препаратов.

Задачей изобретения является исключение из технологического цикла получения диагностикума клещевого энцефалита токсичных химических реагентов и повышение при этом чувствительности и специфичности диагностикумов при снижении затрат времени и средств на получение препарата с расширением ассортимента диагностикумов, в частности клещевого энцефалита, повышенной чувствительности.

Задача решается тем, что при приготовлении препарата для обработки вируссодержащей суспензии применяют воздействие на нее ультразвуковым излучением (УЗ) при частоте 22 кГц в течение 1 мин, повторяя эту процедуру трижды с интервалом 2 мин, при этом УЗ обработку проводят на аппаратах типа УЗДН-1 или УЗДН-А с использованием универсального излучателя на 22 кГц, а пробы сыворотки крови больных клещевым энцефалитом подвергают антиингибиторной обработке каолином при рН 7,4, причем в качестве штаммов вируса клещевого энцефалита предпочтительно используют: эталонный штамм Софьин, авидные штаммы 4072 и 3445, неавидный штамм 80, причем обработка проводится при температуре среды 25-30°С.

Способ осуществляется следующим образом.

Подготовка антигенов:

Используют: 1. Авторский штамм вируса КЭ 4072 /Кокорев B.C. Мельникова Е.Э., Колотвинов С.В. и др./, депонированный в ГКВ под № 633. Штамм 4072 выделен в 1966 г. из крови больного, высокочувствителен к нейтрализующему действию специфических антител (по результатам перекрестной кинетической РТГА), авиден, чем отличается от эталонного штамма Софьин;

2. Авторский штамм вируса КЭ 3745 /Колотвинов С.В., Кокорев B.C., Мельникова Е.Э и др./, депонированный в ГКВ под №636. Штамм выделен из крови человека без клинических проявлений заболевания, ранее подвергавшегося нападению клещей, высокочувствителен к нейтрализующему действию специфических антител, авиден;

3. Авторский штамм вируса КЭ 80 /Кокорев B.C., Мельникова Е.Э., Колотвинов С.В. и др./, депонирований в ГКВ под №634. Штамм выделен и клещей Иксодес персулькатус, мало чувствителен к нейтрализующему действию специфических антител, неавиден;

4. Эталонный штамм Софьин вируса КЭ, полученный из ГКВ Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН.

Гемагглютинирующие антигены указанных вирусов получают методом боратно-солевой экстракции с обработкой протаминсульфатом. Для этого готовят 10 или 20% суспензию из мозга новорожденных белых мышей на боратном буферном растворе рН 9,0-9,3 на холоду, центрифугируют на холоду в течение 1 часа при 10000 об/мин. К надосадочной жидкости добавляют раствор протаминсульфата соответствующей концентрации в количестве 0,1 объема, т.е. на 10 мл добавить 1 мл раствора протаминсульфата. Раствор протаминсульфата готовят на физиологическом растворе в концентрации 50 мг/мл ил 25 мг/мл для 20% и 10% суспензии мозга соответственно. Смесь ставят на 30 минут в ледяную баню, периодически помешивая, а далее центрифугируют 15 минут при 2500 об/мин на холоду. Прозрачная надосадочная жидкость является антигеном.

Подготовка проб сыворотки крови.

Удаление сывороточных ингибиторов каолином при рН 9,0 и удаление нормальных сывороточных агглютининов проводят по общепринятой методике. Обработку проб сыворотки крови суспензией каолина при рН 7,4 проводят следующим образом. К 0,2 мл исследуемой пробы добавляют 0,8 мл боратного буферного раствора с рН 7,4 и 1 мл 25% суспензии каолина, приготовленной на боратном буферном растворе с рН 7,4. Полученную смесь встряхивают 25 мин, а затем центрифугируют при 1000 об/мин 30 мин. К надосадочной жидкости добавляют 2 капли (0,05 мл) отмытых гусиных эритроцитов (для удаления нормальных сывороточных агглютининов) и периодически встряхивают в течение 25 мин. Надосадочную жидкость, полученную после повторного центрифугирования, доводят до рН 9,0 раствором NaOH.

Новая предложенная операция - Обработка антигенного препарата - диагностикума ультразвуком.

Обработку антигенного препарата ультразвуком проводят на аппарате УЗДН-1 или УЗДН-А (выходной мощности 400 Вт) при частоте 22 кГц в течение 1 мин, повторяя эту процедуру трижды с интервалом 2 мин, при температуре среды 25-30°С. Обработанный материал центрифугируют при 12000 об/мин в течение 15 минут.

Технологические параметры предложенного способа ультразвуковой обработки: частота УЗ 22 кГц; время обработки УЗ - в течение 1 мин; повторность УЗ обработки - 3 цикла, температура среды и режимы центрифугирования после УЗ - определены и обоснованы практическим путем в лабораторных условиях по результатам многочисленных исследований с учетом анализа и обзора по доступным источникам, проведенных в лаборатории трансмиссивных вирусных инфекций и клещевого энцефалита ФГУН «Екатеринбургский научно-исследовательский институт вирусных инфекций» и лаборатории кафедры микробиологии и вирусологии ФГОУ ВПО «Уральская государственная сельскохозяйственная академия» г.Екатеринбург.

Пример 1. По предлагаемому способу получают гемагглютинирующие антигены из эталонного штамма Софьин и авидного штамма 4072, которые используют при исследовании парных проб сывороток крови больных клещевым энцефалитом.

Обработка вируссодержащих суспензий УЗ изменяет не только и не столько их гемагглютинирующую активность (титры гемагглютининов, как правило, возрастают в 2 раза), сколько активность в реакции торможения гемагглютинации (РТГА): сокращается число так называемых серонегативных проб, прирост титров антител выше, чем при использовании необработанного ультразвуком препарата (Таблица 1 и Таблица 2), что является неочевидным эффектом предложенного способа с ультразвуковой обработкой препарата вместо введения химических консервантов - стабилизаторов.

Таким образом, из таблиц 1 и 2 видно что, при использовании УЗ-антигенов повышается диагностическая ценность РТГА, а именно: до 33% возрастает частота подтверждения клинического диагноза «клещевой энцефалит» по 2-4-кратному приросту титра антител по сравнению с реакцией, поставленной с необработанным УЗ диагностикумом.

Таблица 1 Исследование проб сывороток крови больных КЭ в РТГА с диагностикумом из эталонного штамма Софьин, обработанным ультразвуком Парные пробы сывороток крови больных Титры антигемагглютининов в РТГА с УЗ-диагностикумом из штамма Софьин Необработанный препарат Обработанный УЗ препарат 4501 1 1:20 1:320 2 1:20 1:1280 Х-ов 1 1:160 1:320 2 1:160 1:640 И-ев 1 1:80 1:160 2 1:80 1:320 4512 1 1:20 1:40 2 1:40 1:80 4271 1 1:160 1:320 2 1:320 1:1280

Таблица 2 Исследование проб сывороток крови больных КЭ в РТГА с диагностикумом из авидного штамма 4072, обработанным ультразвуком Парные пробы сывороток крови больных Титры антигемагглютининов в РТГА с УЗ-диагностикумом из штамма 4072 Необработанный препарат Обработанный УЗ препарат 4501 1 1:320 1:320 2 1:640 1:1280 Х-ов 1 1:640 1:640 2 1:640 1:1280

Пример 2. Аналогичным способом приготовленные диагностикумы используют в РТГА при исследовании проб сывороток крови, подвергнутых предварительно антиингибиторной обработке каолином при рН 7,4. Диагностический прирост титров антител возрастает в 8-32 раза (Таблица 3).

Разработанные и использованные в диагностической практике препараты и методики позволяют подтверждать клинический диагноз «клещевой энцефалит» своевременно и практически в каждом конкретном случае без применения дорогостоящих и дефицитных серологических тестов.

Таблица 3 Зависимость результатов РТГА от способа антиингибиторной обработки сыворотки крови больного и УЗ-обработки гемагглютинирующего антигена вируса КЭ (штамм Софьин) № парной пробы сыворотки крови рН среды при антиингибиторной обработке сыворотки Титры антигемагглютининов в реакции с диагностикумом Необработанным Обработанным ультразвуком 4968 1   1:40 1:80 2 9,0 1:40 1:80 1   1:20 1:40 2 7,4 1:320 1:1280 4569 1   0 1:20 2 9,0 1:40 1:40 1   1:10 1:20 2 74 1:40 1:160

Пример 3. По предлагаемому способу с использованием УЗ обработки в указанных параметрах обработан гемагглютинирующий антиген вируса КЭ из неавидного штамма 80. По данным перекрестной РТГА отмечено, что авидитет неавидного штамма возрастает до уровня авидного (Таблица 4). Этот феномен (неочевидный эффект) выявлен впервые за всю историю изучения авидитета вирусных и бактериальных антигенов в практике и по доступным источникам.

Предлагаемый способ с УЗ обработкой препарата в указанных параметрах делает возможным использование практически любого штамма вируса КЭ для диагностических целей без трудоемких поисков природных авидных вариантов возбудителя, что является новизной способа.

Таблица 4 Влияние обработки ультразвуком на активность антигенного препарата из авидного и неавидного варианта вируса клещевого энцефалита в реакции с антителами Штамм вируса КЭ 3745 /авидный/ 80 /неавидный/ Антигенный препарат необработанный обработанный ультразвуком необработанный обработанный ультразвуком Результат РТГА с иммунной кроличьей сывороткой к штамму Софьин 1:1280 1:2560 1:320 1:2560

При УЗ воздействии на вирусы в указанных параметрах отрываются или освобождаются крупные макромолекулярные комплексы, которые при дальнейшем озвучивании «расшатываются» с обнажением большего количества активных антигенных групп (демаскирование или деэкранизация антигенных детерминант). Не исключено, что УЗ обработка вируссодержащих субстратов может повысить и эффективность вакцинных препаратов, если иммуногенное и превентивное действие последних определяется активностью тех же антигенных детерминант, что и при приготовлении диагностикума клещевого энцефалита.

Предложенный способ получения диагностикума клещевого энцефалита может найти широкое практическое и научное применение в медицине и ветеринарии, расширяя ассортимент необходимых эффективных диагностикумов клещевого энцефалита при минимальных затратах труда и с использованием распространенного оборудования.

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии. Способ предусматривает ультразвуковую обработку вируссодержащей суспензии из различных, в том числе авидных, штаммов вируса клещевого энцефалита. При этом обрабатывают ультразвуком при частоте 22 кГц в течение 1 мин, повторяя эту процедуру трижды с интервалом 2 мин, на аппарате УЗДН-1 или УЗДН-А. Способ позволяет повысить диагностическую эффективность получаемого препарата, что выражается в возрастании титров детектируемых в сыворотках крови больных антител, диагностических приростов титров антител в реакции торможения гемагглютинации и достоверности частоты подтверждения клинического диагноза «клещевой энцефалит» до 33%. Изобретение может быть использовано при производстве диагностических препаратов и для повышения эффективности серологической диагностики клещевого энцефалита. 1 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Способ получения диагностикума клещевого энцефалита, включающий приготовление вируссодержащей суспензии на буферном растворе на холоду, антиингибиторную обработку каолином, центрифугирование и отделение надосадочной жидкости с последующим физическим воздействием на нее для активации, отличающийся тем, что вируссодержащую суспензию из штаммов вируса клещевого энцефалита обрабатывают ультразвуком при частоте 22 кГц в течение 1 мин, повторяя процедуру трижды с интервалом 2 мин, при этом ультразвуковую обработку вируссодержащей суспензии проводят на аппаратах УЗДН-1 или УЗДН-А с использованием универсального излучателя при температуре суспензии 25-30°С.

2. Способ получения диагностикума клещевого энцефалита по п.1, отличающийся тем, что в качестве штаммов вируса клещевого энцефалита используют: эталонный штамм Софьин, авидные штаммы 4072 и 3445, неавидный штамм 80.