Способ индикации внутриклеточногоВиРуСА Советский патент 1981 года по МПК C12K7/00 

лированной водой (в целях удаления несвяаавшейся сыворотки) и подвергают не гативному контрастированию.

При необходимости выявления и идентификации вирусов в тканях и органах небольшие кусочки (около 1 мм ) последних помещают на металлическую пластинку , подвергают трехкратному замораживанию и оттаиванию, добавляют 1-2 капли разведенной антисыворотки, ресуспендируют в ней лизированную ткань КО1ЩОМ пастеровской пипетки, снова подвергают трехкратному замораживанию . и оттаиванию и далее обрабатывают так же, как клетки культуры ткани.

Пример. Выявление и идентификация вируса Синдбис в культуре клеток почек китайского хомяка.

Вирус Синдбис обычным образом выращивают в культуре клеток почек китайкого хомяка в 1ОО мл флаконах при 37 С. Исходный титр вируса, используемого для заражения, составляет 5-15 БОЕ/мл. Спустя 24 ч после заражения клетки механически снимают со стекла и центрифугируют вместе с культуральной жидкостью в течение 5 мин при 100О об/мин. Над осад очную жидкост сливают, ее следы удаляют фильтровальной бумагой. К клеточному осадку добавляют 1-2 капли иммунной сыворотки в разведении 1:10 и ресуспендируют в ней клетки концом пастеровской пипетки. Каплю полученной взвеси переносят на металлическую пластинку диаметром 1-3 см и подвергают трехкратному замораживанию ц оттаиванию попеременным помещением пластинки на поверхность сухого льда и ладони руки. После этого каплю взвеси лизированных в результате замораживания и оттаивания и ресуспен- дированных в сыворотке клеток помещаю на предметное стекло и инкубируют в течение 15-ЗО мин во влажной камере (чашка Петри со смоченной водой фильтровальной бумагой). Затем на каплю накладывают предметные сетки, покрытые формваром и углеродом спустя 1-3 мкк ополаскивают юс дистиллированной водой и наносят каплю фосфорновольфрамовой кислоты с рН 6,5, избыток которой удаляют краем фильтровальной бумаги. После этого сетки просматривают в электроном микроскопе при увеличении 4ОООО5О ООО. Вы5 вляют одиночные или аггре- гированные вирусные частицы покрытые ареолом антител сыворотки. Контролем специф1гчности реакции служат клетки ресуспендированные в дистиллированной .

воде, нормальной или 1етерологичной сыворотке.

П р и м е р 2 . Выявление и вдентификация вируса клещевого энцефалита в культуре клеток почек эмбриона свиньи

Вирус клещевого Э1щефалита (штамм 718) выращивают обычным образом в пробирочной культуре клеток почек эмбрина свиньи. На 2-ые сутки после заражения клеточный монослой механически снимают со стекла пробирки и далее обрабатывают согласно примеру 1, за исключением того, что иммунная сыворотка используется в разведении 1:4. При электронномикроскопическом изучении в препаратах выявляют аггрегаты полных и пустых вирусных частиц.

П р и м е р 3 . Выявление и идентификация вируса Западного Нила в культуре клеток комаров AedeBoeg vpti. Культуру клеток комаров А ciegvpti выращивают в 5О мл флаконах на обогащенной среде С-45 с 10% нормальной телячьей сыворотки и инкубируют при 26°С После сформирования монослоя клетки заражают вируссодержащей суспензией мозга новорожденных белых мыщей с титром .вируса 7,5-8,0 2.D 5О мл.

После адсорбции вируса его удаляют из флаконов,клетки промывают ростовой сред9Й, добавляют среду С-45 с 5% нормальной телячьей сыворотки. Перевивки зараженной культуры проводят каждые 5-6 сут. После трех субкуяьти- вирований зараженные культуры помещаю в условия субоптимальной температуры (1О-20 с) на ЗО сут, меняя затем температурный режим на оптимальный (2бС). Для анализа берут материал на третьи сутки после заражения, на ЗО сут инкубации при субоптимальной температуре и на первом- пассаже после изменения температурного режима на оптимальный. Обработку материала ведут согласно примеру 1. Иммунную сыворотк используют в разведении 1:5. В препаратах выявляют агрегаты покрытых антителами вирусных частиц.

П р и м е р 4 . Выявление и идентификация вируса Западного Нила в мозгу йоворожденных белых мышей. Для заражения используют слив культуральной жидкости с культуры- клеток комаров , хронически инфицированной вирусом Западного Нила, О ОЗ мл культуральной Ж1ЩКОСТИ вводят в мозг новорождеш ых белых мьшей. На 3 сут после зарешения мышей забивают, выделяют небольшие кусочки (около I мм)

коры головного мозга, помещают их на металлическую пластинку и подвергают трехкратному замораживанию и оттаиванию. Затем на кусочки ткани наносят каплю неразведенной иммунной сыворотки ресуспендируЕот в ней частично лизнрован Ную ткань концом пастеровской пипетки, снова подвергают трехкратному замораживанию и оттаиванию и далее обрабатывают согласно примеру 1. При просмотре препаратов в электронном микроскопе выявляют аггрегированные сывороткой скопления вирусных частиц. Контролем специфичности реакции служат кусочки мозговой ткани ресуспендированной в иммунной сыворотке против вируса клещевого энцефалита.

П р к м е р 5 . Выявление и индентификация вирусов, изолированного из москитов P1lEeboi:.oiiiU9 &РВирусом, изолированных из москитов Р п беЪоtowus Рзаражают интрацеребрально новорожденных белых мышей. На 3 сут после заражения при проявлении вьфаженных клинических 1физнаков заболевания мышей забивают, вьщеляют кусочки коры головного мозга, которыеобрабатывают согласно примеру 4. В качестве иммунной сыворотки используют асцитную жидкость иммуннизированных вирусом белых мьпией. При просмотре препаратов в электронном микроскопе выявляют аггрегированные сывороткой частицы, характерные для группы рабдовирусов.

Предлагаемый способ позволяет проводить в отличии от существующих, выявление и идентификацию внутриклеточного вируса как в клетках тканевых культур различного происхождения, так и в тканях органов зараженных животных

Способ является быстрым, так как препараты готовы для просмотра и изучения в электронном микроскопе через ЗО-5О мин после взятия материала, что в 3-5 раз быстрее способа иммунноэлоктронномикроскопического выявления вtфyсов с использованием высокоскоростного центрифугирования.

Способ не требует использован|1я какого-либо специального оборудования или реактивов и может быть осущ€;ствлен

на базе любой электронномикроскопичес- кой лаборатории.

Предлагаемый способ является специфичным, так как аггрегация вирусных частиц имеет место лишь щзи использовании гомологичной иммунной сыворотки и отсутствует при ресуспевдировании клеток и тканей в дистиллированной воде, нормальной или гетерологичной сыворот ке.

Формула изобретения

Способ индикации внутриклеточного вируса путем разрушения вируссодержа25 щих клеток или кусочков органного материала замораживанием и оттаиванием, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и упрощения способа, перед замораживани30 ем клетки или кусочки органного материала ресуспенаируют в иммунной сыворотке

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

l.Doane F.W Ddentificoiticw of MIruse.s bv lynmunoebect-von ynicroscopv ViraC im unodiagnosis,Accid.

One N&wJovV,19l4,p..

2. Практическая вирусология. Под ред. Сюрина В. Н., М., Колос 1970, с. 9О-91.