Смесь для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот растений Советский патент 1992 года по МПК C12N15/01 

Изобретение относится к физиологии, биохимии и может быть использовано в мо- лекулярно-биохимических исследованиях и гённоинженерном конструировании принципиально новых организмов.

Известна смесь для проведения электрофореза биологических полимеров на основе трис-ацетатного буфера.

Известна смесь для проведения элект- рофореза биологических полимеров, содержащая сульфид.

Указанные смеси мало пригодны для электрофореза нуклеиновых кислот, что обусловлено их малой буферной емкостью, необходимостью присутствия в электрофо- ретических препаратах железа, которое в нуклеиновых кислотах практически отсутствует.

Наиболее близкой к предлагаемой является смесь для проведения электрофореза, в качестве инкубационной смеси для электрофореза используют трис-боратный буфер (ТББ), рН 8,0 содержащий 0,089 М грис-бо- рата, 0,089 М борной кислоты 0,002 М эти- лендиаминтетрацетата (ЭДТА).

Недостатками данной среды являются малая разрешающая способность, не позволяющая разделить близкие по молекулярной массе фрагменты нуклеиновых кислот (НК) и неполная характеристика электрофо- ретических спектров НК, показывающап меньшее количество фрагментов, нежели есть объективно.

Целью изобретения является повышение разрешающей способности смеси.

Поставленная цель достигается тем, что смесь для электрофореза нуклеиновых кислот, включающая трис-борат, борную кислоту и этилендиаминтетрацетат, дополнительно содержит гибберелловую кислоту при следующем соотношении компонентов (в мольных %):

Чляя

XI ел

4Ь

N 1 оо

«шг

Трис-борат46,84-49,30

Борная кислота46,84-49,30

Этилендиаминтетрацетат1,06-1,12

Гибберелловая

кислота0,02-5,62

Пример 1. Препарат дезоксирибо- нуклеиновой кислоты (ДНК) из 12 дневных проростков риса вносили в лунку горионтального агариэованного геля (концентрация агарозы 0,9%) и подвергали электрофорезу при параметрах электромагнитного поля (сила тока 192 МА, напряжение 84 мВ). Длительность процесса 5 ч.

В качестве инкубационной смеси во время электрофореза использовали смесь- прототип: водный трис-боратный буфер, рН 8,0, содержащий 0,089 М трис-бората, ,089 М борной кислоты и 0,002 М отклди- минтетрацетата (ЭДТА), что в молярных процентах составляет соответствие: 49,44%, 9,44%, 1,12%.

По окончании электрофореза гель, заключающий в себе разделенные фрагменты НК прокращивали в растворе бромистого тидия, а затем просматривали на трансилюминаторе. Результаты электрофореза: тепень разделения фрагментов, их колиество и качественные характеристики приведены в таблице. Как следует из представленных в таблице данных при использовании смеси-прототипа удалось разделить низкомолекулярные и высокомолекулярные рагменты ДНК.

Пример 2. Операции выполняли, как описано в примере 1. В качестве инкубационной смеси для проведения электрофореза использовали заявленную смесь, которая содержала компоненты (в мол.%): трис-бората 49,44, борной кислоты 49.44, ЭДТА

1.11,гибберелловой кислоты (ГК) 0,01.

Как видно, из приведенных в таблице данных, при использовании заявленной смеси, содержащей гиббереловую кислоту (ГК) (мол,%) 0,01, отличия от показателей смеси-прототипа отсутствуют.

Пример 3, Операции выполняли, как описано в примере 1. В качестве инкубационной смеси для проведения электрофореза использовали заявленную смесь, которая содержала компоненты (в мольных %): трис- бората 49,44, борной кислоты 49,44, ЭДТА

1.12,ГК-0,02.

Как видно из приведенных в таблице данных, при использовании заявленной смеси, содержащей указанное количество ГК, удается существенно (на высшем уровне статистической достоверности) повысить разрешающую способность электрофореза по сравнению с средой-прототипом и раэделить близкие по массе фрагменты, что в свою очередь, приводит к повышению полноты электрофоретического спектра, вместо двух фрагментов мы наблюдаем пять.

Пример 4. Операции выполняли, как

описано в примере 1, В качестве инкубационной смеси для проведения электрофореза использовали заявленную смесь, которая содержала компоненты (в мол.%): трис-бо0 рата 49,17, борной кислоты 49,176, ЭДТА 1,10, ГК 0,56.

Из приведенных в таблице данных видно, что при использовании заявленной смеси, содержащей ГК (в мол.%) 0,56, удается

5 существенно повысить разрешающую способность электрофореза и разделить близкие по массе фрагменты, что, в свою очередь, приводит к повышению полноты электрофоретического спектра, вместо двух

0 фрагментов мы наблюдаем шесть.

Пример 5. Операции выполняли, как описано в примере 1. В качестве инкубационной смеси для проведения электрофореза использовали заявленную смесь, которая

5 содержала компоненты (в мол.%): трис-бората 46,84, борной кислоты 46,84, ЭДТА 1,06, ГК 5,62.

Результаты электрофореза приведены в таблице. Из приведенных данных видно, что

0 при использовании заявленной смеси, содержащей ГК (в мол.%) 5,62, удается повысить разрешающую способность электрофореза по сравнению с прототипом, однако она снижается в сравнении с концентрациями

5 ГК в средах (в мол.%) 0,02, 0,56.

Пример б, Операции выполняли, как описано в примере 1. В качестве инкубационной смеси для проведения электрофореза использовали заявленную смесь, которая

0 содержала компоненты (в мольных %): трис- бората 31,79, борной кислоты 31,79, ЭДТА 2 0,71, ГК 35,71.

Из приведенных в таблице данных видно, что при использовании вышеуказанной

5 среды разрешающая способность остается на уровне варианта с концентрацией ГК (в мол.%) 5,62.

Таким образом, предлагаемая смесь позволяет повысить разрешающую способ0 ность электрофореза НК, следствием чего является увеличение полноты характеристики электрофоретического спектра НК, позволяет точно различать близкие по электрофоретическим характеристикам

5 фрагменты, причем это разделение не требует дополнительных манипуляций с НК, Использование заявленной смеси позволяет повысить эффективность генно-инженерного процесса, направленного на трансформацию клеток живых организмов.

Формула изобретения Смесь для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот растений, включающая трис-борат, борную кислоту и этилендиаминтетрацетат, отличающая-5 с я тем, что, с целью повышений разрешающей способности смеси, она дополнительно содержит гибберелловую кислоту при

следующем соотношении компонентов, мол,%:

Трис-борат46,84-49,30

Борная кислота46,84-49,30

Этилендиамин- тетрацетат 1,06-1.12

Гибберелловая

кислота

0,02-5,62

Использование: физиология, биохимия, молекулярно-биологические исследования и генно-инженерное конструирование принципиально новых организмов. Сущность изобретения: смесь для электрофореза включает трис-борат, борную кислоту, этилендиаминтетрацетат,- а также гиберел- ловую кислоту при следующем соотношении компонентов, мол.%: трис-борат 46,84-49,30: борная кислота 46,84-49,30; этилеидиаминтетрацетат 1,06-1,12; гиббе- релловая кислота 0,02-5,62. 1 табл.