Способ определения биологической активности метаболитов гриба ТRIсноDеRма LIGNоRUм Советский патент 1992 года по МПК A01N63/00 

Изобретение относится к области изучения биологически активных веществ микроорганизмов и биохимии,

Известен способ определения токсических веществ Aspergillus fumlgatus, включающий культивирование гриба, экстракцию и концентрацию экстракта, разделение веществ тонкослойной хроматографией на пластинах Merck F-254 в системе 5% мета- Нол в метмленхлориде.

Недостатки известного способа заключаются в том, что он не использовался для определения биологической активности метаболитов с использованием операции биоавтографии;

он не пригоден для проведения биоавтографии в связи с тем, что система разделения 5% метанол в метиленхлориде на других аналогичных типах пластинок не делит метаболиты, разделяемые ею на пластинках Merck 60 F-254; а пластинки Merck 60 F-254 не пригодны для биоавтографии вследствие того, что они обладают собственной антибиотической активностью.

Наиболее близким по технической сущности является способ определения биологической активности метаболитов Trlchocierma lignorum, предложенный, включающий культивирование гриба, экстракцию и концентрацию экстракта, разделение веществ бумажной хроматографией в 10 системах растворителей, предложенных Всесоюзным институтом антибиотиков с последующей биоавтографией хроматограмм на Baciiius subtiilis.

Недостатком известного способа является низкая эффективность каждой из предложенных систем, так как ни в одной из них не удалось удовлетворительно разделить индивидуальные вещества способом; большое количестоо операций, в сочетании с их низкой эффективностью, а от этого большая длительность процесса; ограниченность применения способа, определяемая более низкой чувствительностью бумажной хроматографии по сравнению с тонкослойной хроматографией,

Целью заявляемого изобретения является повышение эффективности способа.

Поставленная цель достигается тем, что по способу, включающему культивирование гриба, экстракцию культуральной жидкости

СО

rsasSi

хлороформом, концентрацию экстракта, разделение и биоавтографию метаболитов, разделение ведут методом тонкослойной хроматографии на пластинках SHufoi в системе 1-28% этанола в хлороформе, биоавтографию метаболитов осуществляют с использованием пластинок Sllufol.

Способ осуществляют следующим образом.

Гриб Trichoderma Ngnorum культивируют глубинным способом в течение 5 суток. Культуральную жидкость (КЖ) фильтруют и экстрагируют хлороформом трижды (100, 400 и 400 мм хлороформа на каждый литр фильтрата), Экстракт концентрируют упариванием под вакуумом Индивидуальные вещества разделяют тонкослойной хроматографией (ТСХ).

Пример 1. Для экспериментальной проверки заявляемого соотношения компонентов смеси разделения концентрат куль- туральной жидкости разгоняют на пластинках Silufol UV-254 о заявляемой смеси.

соотношения компонентов смеси и результаты указаны в таблице.

Вывод: удовлетворительное разделение и выделение индивидуальных компонентов можно проводить при составе смеси 0-28% этанола в хлороформе.

Пример 2. Для экспериментальной проверки заявляемого способа концентрат хлороформного экстракта КЖ разгоняют в системе 5% этанола в хлороформе на пластинках Silufol UV-254 Пластинки1 разовое ют вдоль для грубой проверки биологической активности; из пластинок вырезают полоски, соответствующие гыяв- ленным индивидуальным веществам п,ля более тонкой проверки; пластинки, полученные по пп. 1 и 2, помещают на Чапек-агар с тест-организмом (BaciMus subtltlis). Результаты четко проявлялись после 2 суток выращивания в термостате при температуре 28°С.

Выводы. Заявляемый способ пригоден для проверки врществ хлороформного экстракта КЖ Trichoderma llgnorum на биологическую активность Пластинки Silufol UV- 254 не обладают собственной антибиотической активностью. Система 5% этанола в хлороформе (как показала биоавтография)

разделила все наличные биологически активные вещества хлороформного экстракта. Пример 3. Для экспериментальной проверки соотношения компонентов смеси, предложенной австралийскими авторами

(5% этанола в метиленхлориде), вещества хлороформного экстракта наносили на пластинки Merck 60 F-254 и Silufol UV-254. Разделения веществ на пластинках Silufol не произошло.

Вывод. Предложенная австралийскими

авторами смесь для разделения не работает

на пластинках Silufol UV-254, не обладающих

собственной биологической активностью.

Пример 4. Для проверки пригодности

способа разделения, предложенного австралийскими авторами для биоавтофафми, пластинки Merck 60 F-254, полученные, как в примере 3, наносили на среду с Вас subtll is,,KaK в примере 2. Результаты

калибровались по стрептомицину Обнаружено, что и в контроле пластинки Merck 60 F-254 обладают собственной биологической (антибиотической) активностью

Вывод. Пластинки Merck 60 F-254 обладают собственной антибиотической активностью, в отличие от пластинок Siiufo UV-2 34. Вследствие этого пластинки Merck 60 F-254 не пригодны для проведения био- авгографии.

Фор мула изобретения

Способ определения биологической активности метаболитов гриба Trichoderma iignorum, включающий культивирование гриба, экстракцию кулътуральной жидкости

хлороформом, концентрацию экстракта, разделение и биоавтографию метаболитов, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности способа, разделение ведут методом тонкослойной хроматографии на пластинках в системе 1-28% этанола в хлороформе, а биоавтографию метаболитов осуществляют с использованием пластинок sllufof.

Продолжение таблицы

Использование: биохимия, определение биологической активности грибов. Сущность изобретения: проводят культивирование гриба, экстракцию культурэльной жидкости хлороформом, разделение метаболитов осуществляют на пластинах silufo в системе 1-28% этанола в хлороформе, биоавтографию осуществляют на тех же пластинах.1 табл.

Примечание. Et ОН 99,95%, СНС1з - 99,8%.