Способ идентификации патогенных энтеробактерий Советский патент 1992 года по МПК C12Q1/04 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к способам идентификации патогенных энтеробактерий в реакции агглютинации с поливалентными и моноспецифическими иммунными сыворотками, и может быть использовано в бактериологической диагностике кишечных заболеваний и при эпидемиологических исследованиях.

Способ серологической идентификации патогенных энтеробактерий в реакции агглютинации с иммунными сыворотками является одним из наиболее специфичных и позволяет дать серологическую характеристику выделенных штаммов, что особенно важно при дифференцировке культур со сходными биохимическими и иными свойствами. Эти обстоятельства определяют его эпидемиологическую значимость. Вместе с тем, при серодиагностике бактериальных культур возникают трудности, связанные с наличием ииагглютинабельных штаммов энтеробактерий, число которых увеличивается в период, предшествующий эпидемическим подъемам заболеваемости кишечными инфекциями.

В этой связи несомненную актуальность приобретает совершенствование существующих способов устранения ин- наглютинабельности культур энтеробактерий.

Известные пути в данном направлении включают в себя ряд предложенных методических приемов, суть которых состоит: в сеVI

ел со

о VJ ел

лекционировании отдельных колоний,обладающих полным антигенным комплексом; в прогревании культур (для разрушения поверхностного антигена); в проведении многократных пассажей через желчный бульон; в применении кератоконъюнктивальной пробы на морских свинках.

Их использование связано со значительными материальными затратами, а в отдельных случаях нежелательно, так как ведет к увеличению продолжительности бактериологического обследования и удлинению сроков выдачи окончательного диаг- ностического заключения.

Существуют способы-аналоги, предус- матривающие обработку инагглютинабель- ных штаммов патогенных энтеробактерий (в частности Escherichia coli) 50%-ЯЫМ этиловым спиртом в течение 20 ч при 37°С, 1 N HC (20 ч при 37±1°С) для устранения 0-инагг- лютинабельности, связанной с К-айтйгеном (фракции Z).

Однако данные способы не устраняют 0-инагглютинабельности Е. coli, обусловленную фракцией А К-антигена.

Наиболее близким к изобретению является способ, включающий культивирование инагглютинабельных штаммов энтеробактерий на плотной питательной среде Хот- тингерэ (1,5% агар-агара, 0.5% NaCI, содержание аминного азота 170 мг %, рН 7,3) с дальнейшим их исследованием в реакции агглютинации на стекле или в пробирках с живой и гретой культурами.

Однако изложенный способ требует приготовления определенных питательных сред, что делает его громоздким и неприем- лимым для массового применения в сети санитарно-эпидемиологической службы, а, кроме того, не позволяет повысить число серотипированных штаммов выше 50-70% особенно при наличии 0-инэгглютинабель- ности, вызванной наличием К-антигена (фракции А, В, Z).

Цель изобретения - повышение точно- сти и упрощение существующего способа идентификации патогенных энтеробактерий в реакции агглютинации с иммунными сыворотками э а Счет устранения иннагглю- тинабельности бактериальных культур.

Поставленная цель достигается, что инагглютинабельная культура бактерий выращивается при 37±1°С в микроаэробных условиях, которые могут быть созданы в анаэростате (или эксикаторе со свечой), с атмосферой, содержащей от 5 до 10% углекислого газа, а затем производится постановка реакции агглютинации с поливалентными и моноспецифическими иммунными

сыворотками на стекле и (или) в пробирках с живой и гретой бактериальной культурой.

Отличие предлагаемого способа от из,- вестных заключается в том, что культуры, предназначенные для реакции агглютинации, выращивают на обычных питательных средах, но в микроаэробных условиях (например, в эксикаторе со свечой или в анаэростате с искусственно компонуемым газовым составом: азот 78-79%, кислород 11-16%, углекислый газ5-10%), в результате чего значительно повышаются агглюти- набельные характеристики микроорганизмов.

Установлено, что бактерии, выращенные в микроаэробных условиях, приобретают способность агглютинироваться моноспецифичес кими сыворотками в более высоких титрах, достигающих диагностических значений. Результаты серотипирова- ния эшерихий при разных способах их культивирования представлены в табл. 1.

Как видно из табл. 1, оптимальными для выявления специфических антигенов кишечной палочки являются такие условия культивирования, при которых газовый состав атмосферы включает углекислый газ от 5 до 10%, что может быть достигнуто использованием эксикатора со свечой или анаэростата с искусственно компонуемой атмосферой (азот в концентрации 78-79%, кислород 11-16%, углекислый газ 5-10%). При культивировании кишечных палочек к анаэростате с атмосферой, содержащей менее 5% углекислого газа, отмечался менее выраженный эффект, так как меньшее число инэгглютинабельности штаммов приобретало способность агглютинироваться моноспецифическими сыворотками. Использование же микроаэробных условий с созданием в атмосфере более высоких концентраций углекислого газа (больше 10%) не приводило к увеличению количества серотипированных штаммов. Кроме того, со- здание подобных условий требует использования термоанаэростатов и приборов для дозирования газовых смесей, что неприемлемо в работе бактериологических лабораторий СЭС районного уровня в cnhy их слабой материальной обеспеченности.

Рекомендовано ограничить содержание углекислого газа в рамках 5-10%, что может быть достигнуто использованием анаэростата или эксикатора со свечой - приборов, доступных бактериологическим лабораториям любого уровня,

С целью проверки эффективности заявляемого способа было проведено сравнительное исследование по идентификации 47

штаммов энтеробактерий в реакции агглютинации с иммунными сыворотками при постановке реакции как на стекле, так и в пробирках с живой и гретой культурами.

Результаты серотипирования исследованных штаммов микроорганизмов предлагаемым способом и способом-прототипом суммирования в табл. 2.

Как видно из табл. 2, применение предлагаемого способа было более эффективным при идентификации патогенных энтеробактерий, поскольку позволило повысить число серотипированных штаммов в среднем на 25,6% (р 0,01) в сравнении с использованием способа-прототипа. Так, известным способом было идентифицировано 63,8±7,0% (30 штаммов) культур исследованных энтеробактерий, из них: 10 штаммов шигелл (83,3%); 7 - сальмонелл (46,6%); 13 - эшерихий (65,0%), а предлагаемым способом - 89.4±4,5% (42 штамма) бактериальных культур, из них: 12 штаммов шигелл (100,0%); 12 - сальмонелл (80,0%); 18 - кишечной палочки (90,0%).

Число серотипированных штаммов энетробактерий при использовании предлагаемого способа увеличилось как за счет культур, при известном способе проявляющих 0-инагглютинабельность, так и культур, которые по способу-прототипу агглютинировались с сомнительными результатами. Применение предлагаемого способа позволило дать полную серологическую характеристику штаммов энтеробактерий.

Предлагаемый способ диагностики атипичных культур патогенных энтеробактерий осуществляется следующим образом.

На официальный простой питательный агар засевается культура микроорганизмов, атипичная по своим серологическим свойствам. Культура помещается в эксикаторе с хорошо притертой крышкой. Для хорошей герметизации края эксикатора и крышки смазываются вазелиновым маслом. В эксикатор помещается зажженная свеча. Крышка эксикатора сдвигается так, чтобы оставалось пространство, в которое может выходить нагреваемый воздух. В момент угасания свечи крышка сдвигается для полной герметизации эксикатора. Через 18-24 ч инкубации в термостате при 37±1°С, эксикатор открывается, выросшие культуры микроорганизмов изучаются в реакции агглютинации с иммунными сыворотками на стекле или в пробирках с живой и гретой культурами.

Пример 1. Больная П. (история болезни 8129), сотрудница столовой № 1, село Александровка проходила амбулаторное лечение в поликлинике ЦРБ. Диагноз. кишечная инфекция невыясненной этиологии. При прямом бактериологическом обследовании были выделены микроорганизмы по биохимическим свойствам, проходящие каклактозоотрицательные. неподвижные кишечные палочки. К тому же микроорганизмы не типировались дизентерийным бактериофагом, а также не агглютинировались поливалентными и моноспецифическими дизентерийными и

0 эшерихиозными сыворотками. При пассаже через газовую среду эксикатора со свечой культура микроорганизмов приобрела способность типироваться поливалентными и моноспецифическими дизентерийными сы5 воротками и по серологическим свойствам была идентифицирована как шигелла Ныо- кастл. Больная была госпитализирована в инфекционное отделение

Таким образом, применение данного

0 способа позволяет восстановить агглюти- набельные свойства выделенного микроорганизма, что позволило прервать эпидемиологическую цепочку.

Пример 2. Больная Р (ист. болезни

5 9225) 15 лет, была госпитализирована в инфекционное отделение Александровской ЦРБ Оренбургской области с диагнозом: острая дизентерия. При бактериологическом исследовании кала была выделена дизенте0 рийная палочка Штуцера-Шмитца (Sh. dysenterlde II) с характерными биохимическими и серологическими свойствами. При контрольном посеве после проведенного лечения был выделен микроорганизм, по

5 биохимическим свойствам принадлежащий бактериям рода Шигелла. Серологически же выделенный микроорганизм типировался как кишечная палочка 0144:К°. С дизентерийными диагностическими

0 (поливалентной и моноспецифической) сыворотками микроорганизм не давал реакции агглютинации. Пассаж через питательную среду, описанную в способе- прототипе, а также трехкратный пересев

5 через желчный бульон оказались безрезультатными. При использовании способа инкубирования в эксикаторе быстро (через 24 ч инкубации) удалось устранить иннагпо- тинабельность шигелл. Больной был назна0 чен повторный курс антибактериальной терапии с учетом чувствительности выделенного микроорганизма к антибиотикам. При двухкратном контрольном бактериологическом исследовании кала после прове5 денного лечения шигеллы выявлены не были.

Пример 3. При бактериологическом исследовании мочи больной Е., 5 лет (история болезни 31149), находящейся на стационарном лечении в Оренбургской детской клинической больнице с диагнозом1 острый пиелонефрит, после проведенного антибактериального лечения из мочи была вы- делена кишечная палочка. Массивность обсеменения мочи, определенная методом секторных посевов, была 10000 КОЕ/мл.

При серотипировании микроорганизмы хорошо агглютинировались моноспецифи- ческой сывороткой 0143:К. При развернутой пробирочной реакции агглютинации культура, предварительно прогретая в течение 1 ч при 100°С, агглютинировалась до 1/8 титра. Негретая живая культура (идентифика- ция К-антигена) хорошо типировалась до диагностического титра. Обычно такие культуры, полученные в ходе бактериологического обследования, считаются нетипичными и по результатам данного анализа дается отрицательный ответ. Использование способа-прототипа не дало каких-либо результатов. При обследовании с использованием предлагаемого способа через 24 ч инкубации в эксикаторе гретая культура агглютинировалась сывороткой в диагностических титрах, нагретая (живая) культура также агглютинировалась в диагностическом титре моноспецифической сывороткой, т. е. удалось восстановить агглютинабельные свойства выделенной культуры энтеропато- генной кишечной палочки Это позволило своевременно изолировать больную и предотвратить вспышку внутрибольничной инфекции,

Таким образом, использование предлагаемого способа в сравнении с существующими методами обеспечивает увеличение числа серотипированных патогенных знте- робактерий, позволяет избежать дополнительных расходов питательных сред, применения вспомогательных способов устранения инагглютинабельности бактериальных культур (выращивание на среде Хоттингера или вжелчном бульоне, селекционирование клонов и др) и дает возможность сократить время выдачи окончательного диагностического заключения по исследуемым микроорганизмам, укорачмсзя время обследования бактериальных культур, которые плохо агглютинируются поливалентными и моноспецифмческимм сыворотками, что делает его особо ценным в эпидемиологическом плане.

Заявляемый способ прост, не требует специального оборудования и доступен для работы в любой бактериологической лаборатории

Формула изобретения

Способ идентификации патогенных эн- теробактерий, включающий посев и культивирование энтеробактерий на питательной среде с последующим проведением реакции агглютинации и идентификацией их по результатам реакции, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа за счет устранения инагглютинабельности и его упрощения, культивирование энтеробактерий осуществляют в микроаэробных условиях с атмосферой, содержащей от 5 до 10% углекислого газа

Использование- медицинская микробиология, бактериологическая диагностика энтеробактерий в реакции агглютинации Для повышения точности способа за счет устранения инагглютинабельности культур энтеробактерий и с целью упрощения способа идентификацию патогенных энтеробактерий проводят путем посева и культивирования энтеробактерий на питательной среде с последующим проведением реакции агглютинации. При этом культивированиеэнтеробактерий осуществляют в микроаэро ьых условиях с атмосферой, содержащей о. 5 до 10% углекислого газа 2 табл (Л С

Таблица 1 Агглютинационные свойства кишечных палочек, выращенных в различных условиях

Таблица 2

Сравнение эффективности различных способов идентификации атипичных культур энтеробактерий в реакции агглютинации

Примечание: р- достоверность различий между способом-прототипом и предложенным способом.