Фрагмент дезоксирибонуклиновой кислоты, кодирующий промотор SP6 РНК-полимеразы Советский патент 1992 года по МПК C12N15/11 

Изобретение относится к молекулярной биологии, генетической инженерии и биотехнологии, и может быть использовано в указанных областях науки для получения РНК в качестве субстрата для изучения и моделирования основных биологических процессов, протекающих в клетке, а функциональные РНК и олигорибонуклеотиды крайне необходимы также для решения целого ряда задач прикладного характера, таких как медицинская диагностика и искусственный синтез белка.

Известны природные промоторы для РНК-полимеразы SP6 со следующей структурой:

-15 -10-5-1 +1

ATTTAGGTGACACTATAGAAGGG, о.ftaa

где А - аденин; Т - тимин; G - гуанин: С - цитидин, а, г, д, с - возможные замены, обнаруженные ь промоторах SP6. Синтез РНК.начинается с +1 позиции-сайта инициации транскрипции.

Один из природных промоторов (SP6 4) был,использован для создания вектора, обеспечивающего эффективную транскрипцию в системе in vitro. Для этого фрагмент

ДНК фага SP6, содержащий промотор, был клонирован в высокоскопийной плазмиде (риС12 или риС 13), которая содержит полилинкер, узнаваемый рядом эндонуклеаз рестрикции. Полученные векторы получили название pSP6 4 и pSP6 5. Схема получения РНК с помощью этих векторов состоит в клонировании заданного фрагмента ДНК по полилинкеру, расщеплении плазмиды ре- стриктазой для обеспечения терминации транскрипции и синтеза РНК в присутствии РНК-полимеразы SP6.

Недостатки прототипа заключаются в том, что при синтезе РНК невозможно получить молекулу, строго соответствующую заданной структуре, так как она всегда будет содержать от 5 до 10 избыточных нуклео- тидов на 5 -конце. Это происходит из-за того, что клонирование ДНК-матрицы происходит по полилинкеру, удаленному от сайта инициации промотора Поэтому транскрибируется +1 +6-фрагмент промотора и последовательность сайта рестрикции, по которому шла встройка.

Цель изобретения - получение фрагмента дезоксирибонуклеиновой кислоты. кодирующего промотор SP6, который посл

с

XJ

сл ю

00 VI

со

зволял бы встраивать фрагмент ДНК непосредственно к сайту инициации транскрипции, синтезировать РНК, не содержащие избыточной последовательности на 5 -кон- це, что позволило бы получить молекулу, строго соответствующую заданной структуре, при сохранении высокой промоторной активности.

Свойствами, обеспечивающими достижение цели мог бы обладать олигодезокси- нуклеотид, содержащий сайт рестрикции, позволяющий расщепить ДНК с образованием тупого конца непосредственно перед сайтом инициации транскрипции. Очевидно, что РНК, синтезируемая под таким промотором будет строго соответствовать ДНК-матрице, т.е. не будет содержать избыточных 5 -нуклеотидных остатков.

Синтезированный олигодезоксинуклео- тид (искусственный промотор), где N - нук- леотидные остатки, были подобраны так, что стала возможной рестрикция с образованием тупого конца в непосредственной близости от сайта инициации, с одновременной высокой транскрипционной активностью олигодезоксинуклеотида Синтезированный двухцепочечный олигодезокси- нуклеотид имеет следующую структуру:

и

AATTCGATTTAGOTGACACTAT

(EcoRI) GCTAAATCCACTGTGATA

G (Barn H I) CCTAG-5 ,

где в скобках указаны липкие концы для клонирования олигонуклеотида по указанным сайтам рестрикции, а в рамку взят сайт узнавания рестриктазой Alul, которая при расщеплении дает тупой конец: , EcTCfGA

ли сравнивать синтезированный олигонук- леотид со структурой природного SP6-npo- мотора, то видно, что для получения Alul-сайта необходимо ввести замены в +2 и +3 позиции. Для доказательства того, что такой измененный олигонуклеотид сохраняет промоторную активность, химически синтезированный олигонуклеотид встраивали в плазмиду pTTQ 19 no EcoR 1 - Bam H (-сайтам. Полученную плазмиду назвали pTTQ 19-SP6 и испытывали на способность инициировать синтез РНК в системе in vitro в присутствии РНК-полимеразы SP6. Эффективность сравнивали с эффективностью транскрипции на природном промоторе в плазмиде pSP6 A.

Пример. Получение 8Р6-лромотора, содержащего Alu 1-сайт в-1+2 позиции и проверка его промоторной активности.

Синтез олигодезоксирибонуклеотидоь проводили на серийном Отечественном синтезаторе Виктория-5М производства

0

СКТБ спецэлектроники и аналитического приборостроения СО АН СССР с использованием фосфитамидного метода по стандартным программам. В реактор

синтезатора помещали 30 мг полимера CPG-500, Fluca, с присоединенными через остаток янтарной кислоты первым звеном - 5-диметокситритилнуклеозидом. Диметок- ситритильную группу удаляли 1,5% трифто0 руксусной кислотой в абс. CHaCIa в течение 30 с. После промывки реактора абсолютным ацетонитрилом в реактор подавали смесь мономера - 5 -0-диметокситритил-М-ацил- дезоксинуклеозид-3 (Р-метил, диизопропи5 ламидо)-фосфита (200 мкл 0,1 М раствора в абсолютном ацетонитриле) и активирующего агента - тетразола (200 мкл 0,45 М раствора в абсолютном ацетонитриле). Время конденсации 80 с. Остаток непрореагиро0 вавшего гидрокомпонента ацилировали 2 мин смесью: уксусный ангидрид-триэтила- м и н-N -метил им ид азол-ацето нитрил (4,5:4,5:1:30). Затем фосфидную группу окисляли 0,1 М йодом в смеси: пиридин-ук5 сусная кислота (9:1) и промывали полимер ацетонитрилом.

После завершения синтеза олигонукле- отиды, присоединенные к полимерному носителю, обрабатывали смесью диоксан-три- этиламин тиофенол (2:1:1) в течение 1 ч для удаления межнуклеотидных метильных групп, затем - концентрированным аммиаком в течение 1 ч при 20°С для удаления нуклеотидного материала с полимера и в

5 течение 15-16 ч при 50°С для деблокирования гетероциклических оснований. Аммиачный раствор упаривали, остаток растворили в 0,1 М трис-буфере (рН 9,0) и выделяли олигонуклеотид с 5 -концевой диметоксит0 ритильной группой, обращенно-фазовой хроматографией на колонке с Lichrosorb RP- 18(Мегск. ФРГ)в градиенте концентраций ацетонитрила 0-30% в 0,05 М LI.-CI04. Нужный пик, элюирующийся при 12-15% ацето5 нитрила, собирали, упаривали, удаляли диметокситритильную группу 80% уксусной кислотой (15 мин при 20rfC), раствор упаривали и остаток рехроматографировали на той же колонке в приведенных выше усло0 виях.

Клонирование двухцепочечного олигонуклеотида в pTTQ 19. Данный плазмидный вектор содержит уникальные сайты для ре- стриктаэ BamHI и EcoRI. 10 мг плазмиды в

55 500 мкл 10 мМ трис-НС1-буфера (рН 7,5), содержащего 10 мМ MgCIa, 10 мМД-меркап- тоэтанола и 50 мМ NaCI (буфер А), обрабатывали 10 ед. акт. BamHI и EcoRI в течение 1 ч при 37°С. Больший BamHI и EcoRI фрагмент выделяли препаративным гель-электрофорезом в 4% полиакриламиде (ПААГ) в трис-боратном буфере (рН 8.3) при напряжении 100 В. Фрагмент из геля извлекали методом электроэлюции.

2 мкг полученного вектора смешивали со 100 пмолями химически синтезированных олигодезоксинуклеотидов, осаждали этанолом, растворяли в 25 мкл 10 М трис- НОбуфера рН 7.5-1 мМ ЭДТА (ТЕ-буфер), добавляли 3 мкл 10-кратного буфера А и 3-5 ед. акт. ДНК-лигазы Т4. Инкубировали 12- 14ч при 10°С. Реакционную смесь осаждали этанолом, растворяли в стерильном ТЕ-бу- фере и трансформировали в EcoLIC600. Наличие встрбйки в выросших клонах подтверждали рестрикционным анализом. ДНК выделяли методом щелочного лизиса.

Первичную структуру клонированного промотора анализировали методом Макса- ма-Гилберта. Из анализа пяти клонов видно, что 2-й и 5-й клоны имеют искомую первичную структуру

-15 Ю & f

AATTCG ATTAGGGGACACTATAGCTG 6 A.

Проверка промоторной активности (синтез РНК в системе In vitro). 0,2 мкг плаз- миды, содержащей промотор, инкубировали в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 40 мМ трис-HCI, рН 7,5, 6 мМ MgClz, 2 мМ спермидина, 10 мМ дитиотрептол. 0.4мМ VTP, GTP и СТР. 0.4 мМ 3H-ATP(t КЮ/ммоль) при 37°С в присутствии 1-2 ед. акт. РНК-полимеразы SP6. Синтезированную РНК определяли в 10 мкл смеси по

радиоактивному кислотонерастворимому продукту на счетчике Магк-МГ.

Результаты синтеза на природном и синтезированном промоторе представлены на чертеже, где дана зависимость включения радиоактивных мононуклеотидов в лотонерастворимый продукт от времени. Видно, что начальные скорости одинаковы. Это свидетельствует о равной эффективности обоих промоторов (у природного

нач.скорость 100% ±10%, у искусственного 105 ±10%).

Таким образом, синтезированный олм- годезоксинуклеотид отвечает поставленной цели: содержит сайт рестрикции для Aful,

является истинным промотором, чья активность сравнима с активность природного. Формула изобретения Фрагмент дезоксирибонуклеиновой кислоты, кодирующий промотор SP6 РНКполимеразы с нуклеотидной последовательностью

30

5 -AATTCGATTTAGGTGACACTATAGCTGGA-3 . полученный с помощью химичзского синтеза.

Использование: молекулярная биология, генетическая инженерия и биотехнология. Сущность изобретения: с помощью химического синтеза получен фрагмент ДНК, кодирующий промотор SP6 РНК-пол- имеразы.

I cp/nxfO

-J

4