Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии, и представляет собой рекомбинантную плаз- мидную ДНК, обеспечивающую высокий уровень продукции интерлейкина-2 человека в клетках дрожжей, способ конструирования данной плазмидной ДНК и штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae-проду- цент человеческого интерлейкина-2.
Целью изобретения является повышение выхода интерлейкина-2 в клетках дрожжей.
Цель достигается созданием плазмиды pjDB(MSIL), обеспечивающей синтез интерлейкина-2 в трансформированных ею клетках дрожжей. Плазмида состоит из следующих элементов:
-фрагмента плазмидной ДНК бифункционального бактериально-дрожжевого вектора pjDB207. ограниченного рестрик- ционными сайтами Hindlll и BamHI, размером 6,6 т.п.о. включающего бактериальный ген устойчивости к ампициллину, бактериальную область инициации репликации, фрагмент дрожжевой двумикронной плазмиды и дрожжевой ген LEU2;
-BamHI - EcoRI фрагмента гена РН05 дрожжей, содержащего промотор этого гена, размером 0,52 т.п.о.;
Si VI
о
00
ел ;ю
-E.coRI - Sail фрагмента плазмиды рАА 12.13-23, несущего часть гена интерлейки-- на-2 человека, включающего всю кодирующую и часть 3-некодирующей области этого гена, длиной 0,56 т.п.о.;
-Smal - BamH фрагмента полилинкер- ного участка плазмиды pUC19 длиной 8 п.о.;
-Sau ЗА-Pstl фрагмента гена РН05 дрожжей, содержащего терминатор транскрипции этого гена, размером 0,37 т.п.о.;
-Pst-Hindlll фрагмента полилинкера плазмиды pUC19 размером 20 п.о.
Общий размер плазмиды 8,0 т.п.о. (молекулярная масса 5,2 Мд).
Для достижения цели разработан способ конструирования плазмиды pjDB(MSlL), заключающийся в том, что плазмиду рАА 12.13 - 23 гидролизуют эндонуклеазой рестрикции Sail, затем обрабатывают ДНК- полимеразой 1 (фрагментом Кленова и рестриктазой EcoRI. Образующийся при такой обработке фрагмент ДНК, включающий всю кодирующую и часть 3-нетранслируе- мой области гена интерлейкина-2 человека, лигируютс вектором pMS46, предварительно гидролизованным рестриктазами EcoRI и Smal. Из полученной таким образом плазмиды pMSILc помощью гидролиза рестриктазами Sail и Hindlll выделяют фрагмент ДНК, несущий промотор и терминатор транскрипции гена РН05 дрожжей с расположенным между ними геном интерлейкина-2. После очистки этот фрагмент лигируют с векторной частью плазмиды pjDB207, гид- ролизованной также рестриктазами Sail и Hindlll. 8 результате получают плазмиду pjDB(MSIL), обеспечивающую высокий уровень продукции интерлейкина-2 в клетках дрожжей.
Выбор плазмиды pMS46 обусловлен тем, что эта плазмида содержит промотор и терминатор транскрипции гена РН05 дрож- . жей, расположенные в одной ориентации, и имеет удобный для клонирования пол- илинкерный участок между промотором и терминатором транскрипции. Промотор гена РН05 в этой плазмиде модифицирован таким образом, что в нем полностью удалена кодирующая область гена РН05, и в участок, соответствующий лидерной области мРНК, встроен фрагмент полилинкера плазмиды pUC19.
Для достижения цели используют штамм дрожжей Saccharomyces . cerevisiae GC-1-GRF18-pjDB(MSIL), полученный трансформацией штамма GC-1-GRF18 плазмидой pjDB(MSIL).
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Клетки бактерий Escherichia coli, содержащие плазмиду pMS46, выращивают в течение ночи в 500 мл питательной среды LB (1% пептона, 0,5%
дрожжевого экстракта, 1 % хлористого натрия), в которую добавлен ампициллин в концентрации 50 мг/л. Клетки собирают центрифугированием (5000 об/мин, 10 мин, 4°С), ресуспендируют в 10 мл буфера для
0 лизиса (25 мл трисгидрохлоридный буфер рН 8,0, содержащий 10 мМ ЭДТА и 50 мМ глюкозы), добавляют 20 мл мг лизоцима и инкубируют 10 мин при 4°С. Далее добавляют 10 мл 0,2 М гидроокиси натрия, содержа5 щей 1% додецилсульфата натрия. После осторожного перемешивания в течение примерно 1 мин раствор нейтрализуют 10 мл ЗМ ацетата натрия, рН 5,3. Далее препарат выдерживают при 4°С в течение 1 ч и
0 центрифугируют при 20000 об/мин. Ксупер- натанту добавляют 0,6 объема изопропило- вого спирта и отделяют осадок центрифугированием 5000 об/мин при 4°С. Осадок высушивают в вакууме, растворяют
5 в 3,5 мл воды, прибавляют 3,5 г хлористого цезия и 100 мкл раствора бромистого эти- дия (10 мг/мл) и центрифугируют при 50000 об/мин в течение 12-16 ч на центрифуге. После центрифугирования отбирают полосу
0 плазмидной ДНК (нижнюю из двух флюоресцирующих полос в центре пробирки), дважды экстрагируют бромистый этидий равным объемом изоамилового спирта, разбавляют раствор хлористого цезия водой в
5 2 раза и осаждают ДНК двумя объемами этилового спирта. Осадок, отделенный центрифугированием (10000 об/мин, 5 мин), промывают 70% этанолом, высушивают в вакууме и растворяют в воде (500 мкл). Кон0 центрацию плазмидной ДНК определяют по оптической плотности раствора при 260 нм, чистоту препарата контролируют электрофорезом в агарозном геле (0,7% агарозы в буфере ТВЕ - 0,1 М трис-борат, содержащий
5 1 мМ ЭДТА и 1 мг/л бромистого этидия).
Гидролиз плазмиды рМ S46 рестриктазой Smal проводят в 10 мМ трис-гидрохло- ридном буфере, содержащем 10 мМ. хлористого натрия. 20 мМ хлористого калия,
0 1 мМ дитиотреитола. К 20 мкг ДНК в объеме 50 мкл прибавляют 30 ед. рестриктазы и проводят реакцию при 30°С в течение 2 ч. Контроль за полнотой гидролиза ведут с помощью электрофореза в агарозном геле. Да5 лее раствор ДНК разбавляют до 200 мкл 5С мМ трис-гидрохлоридным буфером, содержащим 10 мМ хлористого магния, 100 мМ хлористого натрия, 1 мМ дитиотреитола, ЮС мкг/мл бычьего сывороточного альбумине (буфер ВС) и обрабатывают 50 м ед. рестриктазы EcoRI в течение 2 ч при 37°С. Реакционную смесь вносят в лунку (2 х 50 мм) ага- розного геля, приготовленного, как описано выше, и проводят электрофорез при напряжении 5 В/см в течение 2-3 ч. Непосредственно перед полосой линейной формы плазмиды вырезают лунку (3 х 60 мм), помещают в эту лунку диализную мембрану соответствующего размера и заполняют ее буфером ТВЕ. Электрофорез продолжают в течение-еще 10-15 мин, после чего буфер из лунки отбирают, экстрагируют один раз фенолом и один-два раза бутанолом, добавляют 1/10 часть ЗМ натрий-ацетатного буфера, рН 5,3, и три обьема этанола. ДНК отделяют центрифугированием при 10000 об/мин в течение 10 мин, осадок промывают этанолом, высушивают в вакууме и растворяют в 100 мкл воды.
Гидролиз 10 мкг плазмиды рАА 12.13 - 23, выделение которой аналогично выделению плазмиды pMS46, проводят с помощью 30 ед. рестриктазы Sail в 50 мкл буфера ВС в течение 2 ч при 37°С. Далее к раствору ДНК добавляют 80 мкл 100 мМ трис-гидро- хлоридного буфера рН 7,4, содержащего 50 мМ хлористого магния и 10 ед. Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы 1. После инкубации в течение 4 ч при комнатной температуре ДНК-полимеразу инактивируют нагреванием при 65°С в течение 10 мин, после чего добавляют 100 мкл буфера ВС и проводят гидролиз плазмидной ДНК 30 ед. рестриктазы EcoRI в течение 2 ч при 37°С.
Очистку фрагмента размером 560 п.с. проводят, как описано выше для векторного фрагмента плазмиды pMS46, стем дополнением, что рядом с лункой дтя очищаемого препарата ДНК вырезают л/нку (5x3 мм) для нанесения стандартов мслекулярной массы (ДНК фага лямбда, гидролизованная Pstl). Нужную полосу перед элюцией идентифицируют, сравнивая ее подвижность с подвижностью стандартных фрагментов ДНК.
Для получения плазмиды, обозначенной как pMSIL фрагменты ДНК. содержащие промотор и терминатор гена РН05. лигируют с фрагментом ДНК, несущим ген интерлейкина-2. Для этого фрагменты ДНК из плазмид рАА 12.13-23 и pMS46, очистка которых описана выше, смешивают в количестве по 0,1 мкг в 10 мкл 70 мМ трис-гид- рохлоридного буфера, рН 7,6, содержащего 5 мМ дитиотреитола, 5 мМ хлористого магния, 1 мМ АТФ. Для проведения реакции лигирования добавляют 10 ед. ДНК-лигазы фаза Т4 и проводят инкубацию в течение ночи при 4°С.
Полученной таким образом лигазной смесью трансформируют клетки E.coli НВ101. Для этого клетки E.coli выращивают в 100 мл среды LB при 37°С и интенсивном
перемешивании до достижения оптической плотности при 600 нм 0,4-0,5. Культуру охлаждают на льду, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин при 0°С, ресуспен- дируют в 50 мл 0,1 М хлористого кальция,
инкубируют на ледяной бане 40 мин, повторно центрифугируют при тех же условиях, суспендируют в 5 мл раствора хлористого кальция, добавляют глицерин до 20%. Полученные таким образом компетентные клетки расфасовывают аликвотами по 200 мкл и хранят замороженными при -70°С до использования. Для трансформации ком- пенентные клетки E.coli размораживают в ледяной бане, добавляют к суспензии клеток смесь продуктов лигазной реакции и проводят инкубацию в ледяной бане в течение 40 мин. Далее клетки подвергают тепловому шоку в течение 2 мин при 42°С, после чего инкубируют в 1.5 мл среды LB при 37°С
в течение 1 ч. Суспензию клеток концентрируют центрифугированием при 30000 об/мин в течение 10 мин и растирают по поверхности чашки с той же питательной средой, содержащей 2% агара и 50 мг/л
-ампициллина.
Из полученных описанным способом отдельных клонов трансформантов выделяют плазмидную ДНК методом, аналогичным методу выделения плазмиды- pMS46, с тем
отличием, что выращивание клетокЕ.соПвег дут в 10 мл питательной среды и все объемы растворов соответственно уменьшают в 50 раз по сравнению с указанными. Кроме того, вместо центрифугирования в растворе
хлористого цезия используют обработку панкреатической РНКазой. Для этого осадок нуклеиновых кислот, полученный при осаждении изопропанолом, растворяют в 100 мкл буфера для рестрикции и обрабатывают 10 мкл раствора РНКазы (1 мг/мл) в течение 30 мин при 37°С. Такой препарат используют для рестрикционного анализа строения плазмид в индивидуальных клонах. В случае плазмиды pMSIL анализ проводят следующим образом. К порциям по 3 мкл препарата плазмиды добавляют по 7 мкл воды и далее отдельные порции обрабатывают следующими комбинациями ре- стрикционных эндонуклеаз (по 10 ед.): Sal I
+ Hindlll (искомая плазмида дает фрагмент 1760 п.о.), EcoRI + Hindlll (фрагмент 960 п.о.), BamHI + Sail (фрагменты 275, 520 и 560 п.о.). Из отобранного таким образом транс- формантного клона, содержащего плазмиду
pMSIL, препаративно выделяют плазмид- нуюДНК, как описано для плазмиды pVS46.
С целью получения челночной плазмиды pjDB(MSIL) теми же методами препаративно очищают Sall-Hindlll фрагмент плазмиды pMSIL размером 1,76 т.п.о. и векторный фрагмент плазмиды pjDB207, гид- ролизованной теми же рестриктазами. Л игируя два этих фрагмента, проводя трансформацию клеток E.coli и рестрикционный анализ трансфермантных клонов рестриктазгми EcoRI, Sal + Hindlll, BamHI + Sail, отбирают клон, содержащий плазми- ду pjDB(MSIL). Из клеток этого клона выше- описанным методом препаративно выделяют плазмидную ДНК и используют ее для трансформации клеток дрожжей, как описано в примере 2.
Пример2.С целью получения штамма дрожжей Saccharomyces serevisiae, синтезирующего интерлейкин-2 человека, клетки дрожжей штамма GC-1-GRF18 трансформируют плазмидой pjDB(MSIL) следующим образом. Дрожжевой штамм реципиент выращивают на среде УЕРОдо достижения культурной оптической плотности при 600 нанометрах 2-4. Клетки дважды промывают водой и один раз 0,1 М натрийцитратным буфером, содержащим 1 М сорбит, суспендируют в том же буфере и обрабатывают сначала 150 мкл меркаптоэтанола в течение 15 мин при 30°С, а затем 150 мкл глюкуро- нидазы в течение 30-60 мин при той же температуре. Полученные таким образом сферопласты трижды промываютодномоле- кулярным сорбитом, суспендируют в 0,01 М трис-НС буфере, содержащем 0,01 М хлористого кальция и 1 М сорбита, и после добавления 10 мкг ДНК плазмиды pjDB(MSIL) инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем к суспензии клеток добавляют 44% раствор полиэтиленгликоля 4000, вы- . держивают ее 30 мин при 30°С, затем 2 мин при 42°С и высевают глубинным посевом на среду SC. содержащую 1 % агара и гистидин в концентрации 50 мг/л.
Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae GC-1-GRF18-pjDB(MSIL) характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки. Клетки округлой, слегка овальной формы, размером примерно 5-10 мкм, у части клеток наблюдаются прикрепленные к их поверхности дочерние клетки или почки.
Культуралькые признаки. Клетки хорошо растут на полных органических средах: ПЕП - 2% пептона, 2% глюкозы; ПЕПФО - 2% пептона, 2% глюкозы, 0,15% однозаме- щенного фосфата калия. YEPD - 2% пептона, 1 % дрожжевого экстракта, 2% глюкозы.
Помимо полных органических сред клетки хорошо растут на минеральной среде состава: 0,67% Yeast nitrogen base (Difco), 2% глюкозы (среда SC), с добавлением 50 мг/л гистидина, а также на других синтетических средах для дрожжей, содержащих добавку 50 мг/л гистидина.
При росте на твердых средах образуют гладкие, круглые, мутные колонии с матозой поверхностью, светло-кремового цвета, край ровный.
При росте в жидких средах образуют интенсивную ровную муть. Культура имеет характерный запах дрожжей.
Физиолого-биохимические признаки. Клетки растут в пределах 4 - 37°С, при оптимуме 30°С.
При росте в аэробных условиях клетки значительно закисляют культуральную среду. Оптимум рН для роста составляет 3,5- 5,5. .
В качестве источника углерода клетки могут использовать многие простые органи- ческие соединения, в частности глюкозу, сахарозу, глицерин.
В качестве источника азота при условии добавки гистидина клетки могут использовать как минеральные соли в аммонийной форме, так и простые органические соединения - мочевину, аминокислоты.
Клетки способны как к аэробному, так и к анаэробному росту.
Существенными признаками штамма являются потребность в гистидине и протот- рофность по лейцину.
Содержание интерлейкина-2 в штамме GC-1-GRF18-pjDB(MSIL) составляет 1 млн.ед./мл клеточного экстракта. В весо- вом представлении продукции интерлейкина-2 достигает 30-50 мг на литр дрожжевой культуры.
Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae GC-1-GRF18-pjDB(MSIL)-npofly- цент человеческого интерлейкина-2 депони- рован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКМП-У791.
Таким образом, изобретение позволяет достичь уровня синтеза интерлейкина-2 человека 30-50 мг на литр дрожжевой культуры, что соответствует 106 ед. на 1 мл клеточного экстракта. Преимущество изобретения состоит также в том, что по срав- нению с известными- продуцентами интерлейкина-2 на основе E.coli у дрожжей отсутствуют токсические свойства и, следовательно, возможна более эффективная очистка интерлейкина-2 от вредных примесей.
Формула изобретения 1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pjDB(MSIL), обеспечивающая синтез интер- лейкина-2 человека в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae с мол.м. 5,2-Мд и размером 8,0 т.п.о., содержащая - Hindlll - BamHI - фрагмент плазмидной ДНК бифункционального бактериально-дрожжевого вектора pjDB207 размером 6,6 т.п.о., включающий бактериальный ген устойчивости к ампициллину, бактериальную область инициации репликации, фрагмент дрожжевой двумикронной плазмиды и дрожжевой ген LEU2; BamHI - EcoRI - фрагмент гена рН05 дрожжей, содержащий промотор этого гена размером 0,52 т.п.о.; EcoRI-Sal -фрагмент плазмиды рАА 12, 13-23, несущий часть гена интерлейкина-2 человека, включающего всю кодирующую и часть 3-некодирующей области этого гена, размером 0,56 т.п.о.: Smal - BamHI - фрагмент полилинкерного участка плазмиды pUC19 размером 8 п.о.; SauSA - Pstl - фрагмент гена РН05 дрожжей, содержащий терминатор транскрипции этого гена, размером 0,37 т.п.о. Pst - Hindlll - фрагмент полилинкера плазмиды pUC19 размером 20 п.о.; бактериальный ген Ыа, обеспечивающий синтез беталактамазы в бактериях и устойчивость к ампициллину; бактериальный локус ori, обеспечивающий репликацию плазмиды в клетках E.coli; фрагмент двумикронной ДНК дрожжей, обеспечивающий автономную репликацию плазмиды в дрожжах; дрожжевой ген LEU2, обеспечивающий биосинтез изопропилмалат дегидрогеназы в дрожжах и возможность роста мутантов Ieu2 на селективных средах без лейцина; промотор гена РН05 дрожжей, обеспечивающий инициацию
транскрипции гена интерлейкина-2; терминатор транскрипции гена РН05, обеспечивающий правильную терминацию транскрипции гена интерлейкина-2 в дрожжах; уникальные сайты рестрикции: 2EcoRI,
Hindlll, Sail.
2.Способ получения рекомбинантной плазмидой ДНК pjDB(NSIL), обеспечивающей синтез интерлейкина-2 человека в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae,
заключающийся в том, что фрагмент гена интерлейкина-2 из плазмиды рАА 12, 13 - 23, ограниченный рестрикционными сайтами EcoRI и Sail, лигируют с векторной частью плазмиды pMS46, гидролизованной рестриктазами EcoRI и Smal, из полученной плазмиды PMSIL гидролизом рестриктазами Sail и Hindlll вырезают фрагмент ДНК. содержащий состыкованные в правильной ориентации промотор дрожжевого гена РН05,
кодирующую часть гена интерлейкина-2 и терминатор транскрипции гена РН05, далее этот фрагмент лигируют с векторной частью плазмиды pjDB207, гидролизованной рестриктазами Sail и Hindlll, клоны, содержащие необходимые конструкции, отбирают по данным рестрикционного анализа.
3.Штамм дрожжей Saceharomyces cerevisiae ВКПМ У-791 - продуцент интерлейкина-2 человека.
Изобретение относится к биотехнологии. Целью изобретения является повышение выхода интерлейкина-2 в клетках дрожжей за счет конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pjDB(MSIL), разработки способа ее конструирования и создания штамма, трансформированного этой плазмидой. Плазмида содержит ген LEU 2 дрожжей и фрагмент дрожжевой двумикронной ДНК. обеспечивающие ее стабильное поддерживание в дрожжах в высоком числе копий; кодирующий участок гена человеческого интерлейкина-2, фланкированный промотором и терминатором транскрипции гена РН05 дрожжей, а также фрагменты бактериальной ДНК, обеспечивающие репликацию плазмиды в клетках E.coli и несущие ген устойчивости к ампициллину. Клетки дрожжей штамма GC-1- GRF18, трансформированные плазмидой pjDB(MSIL), продуцируют инYepлeйкин-2 в количестве порядка 30-50 мг на литр дрожжевой культуры, что соответствует 10 ед./мл. 3 с.п. ф-лы. (Л С
| ЕПВ, С 12 N 15/00, № 0142268, 1985 |
