Способ количественного определения новокаинамида Советский патент 1992 года по МПК G01N21/78 

Изобретение относится к области аналитической химии, а именно к способам количественного определения новокаинамида. Новокаинамид относится к противо- аритмическим средствам (ПАС). Кроме того в эту группу входят хинидин, аймолин, этмо- зин. Предлагаемый способ позволяет определять повокаинамид в присутствии других ПАС на серийной отечественной аппаратуре.

Известен способ определения новокаинамида путем взаимодействия его с бром- феноловым синим с последующим

фотометрированием полученного окрашенного соединения 1.

Недостатком способа является его невысокая чувствительность (2 мг/мл).

Известен способ определения новокаинамида с использованием в качестве реагента лактата этакридина 2.

Недостатком способа является его сложность, связанная с необходимостью экстракции, а также недостаточно высокая чувствительность - 27 мг/мл.

Наиболее близким к изобретению является способ определения новокаинамида.

ч О О 4 СО 00

основанный на обработке реагентом тропе- олином 00 3.

Недостатком способа является необходимость экстракции, что приводит к сложности епособа, а также его невысокая чувствительность (11 мг/мл).

Цель изобретения - упрощение способа, повышение чувствительности и селективности определения.

Цель достигается тем, что определение новокаинамида проводят путем обработки пробы спиртовым раствором п-диметила- минокоричного альдегида (п-ДМАКА) в присутствии сульфонола с концентрацией в реакционной смеси 4,0 ,0 М при рН 2,0-5,0 с последующим фотометри- рованием полученного раствора.

Эксперимент показал, что растворы, содержащие новокаинамид и органический реагент п-ДМАКА, окрашены в желтый цвет. Спектры поглощения двойных систем в среде цитратных буферных растворов с рН 1,25-6,0 представлены двумя полосами поглощения С Ямакс 265-280 НМ И Амакс 400

нм. Введение третьего компонента - раствора сульфонола приводит к возникновению ярко-малиновой окраски раствора системы.

Спектры поглощения тройных систем новокаинамид-п-ДМАКА-сульфонол пред- ставлены при всех значениях рН тремя полосами поглощения Амакс 280нм , Лмакс 370-400 нм, Лмакс 570нм,АА составляет 170 нм.

Установлены оптимальные условия определения новокаинамида с п-ДМАКА и сульфонолом.

Изучение зависимости светопоглоще- ния систем новокаинамид-п-ДМАКА-сульфонол от рН среды показало, что оптимальной средой являются нитратные буферные растворы с рН 2,0-5,0; 2,,0.

Исследовано влияние СДМАКА на правильность получаемых результатов определения новокаинамида.

Как следует из данных, представленных в табл.1, наименьшие ошибки определения новокаинамида наблюдаются в интервале концентраций 0,1-1,0 мл 0,2%-ного раствора п-ДМАКА (4,5 М СП-ДМАКА 4,5 10 М).

Установлена оптимальная концентрация сульфонола в реакционной системе. Для этого исследовано п систем, содержащих постоянную концентрацию п-ДМАКА (0,1 мл 0,2%-ного раствора), рН растворов была постоянной, равной 4,0.

Установлено, что концентрация сульфонола в различной смеси должна составлять 4,0- 2,0- М, что достигается при добавлении сульфонола в количестве

1-5 мл М.

Все дальнейшие исследования проводили с растворами следующих концентраций: 0,1 мл 0,2%-ного раствора п-ДМАКА; 3 мл М сульфонола, У0бщ 25 мл.

0 Изучена подчинимость системы новокэ- инамид-п-ДМАКА-сульфоиол закону Бугера- Ламберта-Бера, размах варьирования концентраций составлял 1-100 мкг/25 мл. Установлено, что по предлагаемому способу

5 определения новокаинамида можно находить как большие, так и маленькие концентрации противоаритмического средства. Установлено два определяемых диапазона концентраций новокаинамида.

0 I (большие количества) 5-100мкг/25мл, или 0,2-4,0мкг/мл,

II (маленькие количества) 1- 10мкг/25мл, или 0,04-0,4мкг/мл, 5см Доказательство существования диапа5 зона определяемых содержаний новокаинамида приведено в табл.3.

Анализ данных, представленных в табл.З, показал, что ошибки определения соответствуют фотометрическому методу и

0 не прееышают 10% в интервале 5,0- 100,0мкг/25мл при I 1 см, 1.0- 10,0мкг/25мл при I 5 см.

Нижняя граница диапазона определяемых содержаний новокаинамида - 1

5 мкг/15мл, или 0,04мкг/мл - следовательно, это и может быть принято за предел обнаружения.

В литературе 1 указано, что предел обнаружения по методу-прототипу составляет

0 11мкг/мл, следовательно по предлагаемому способу удалось снизить предел обнаружения в 250 раз.

Изучена зависимость предела обнаружения новокаинамида от рН среды и кон5 центрации реагента, з также третьего компонента (табл.4-6).

Анализ данных, представленных в табл.4-6, показал, что ошибка определения предела обнаружения новокаинамида ми0 нимальна при концентрации п-ДМАКА 4.56Х х 105-4,56 . концентрации сульфонола 4 .0 . рН2-4.

Исследован широкий круг лекарственных препаратов, которые могут быть назна5 чены больным совместно с новокаинамидом.

Соотношение новокаинамида к мешающему компоненту было выбрано 1:1 согласно прописываемой рецептуре в медучреждениях. Как видно из данных.

представленных в табл.7, препараты из груг.п антиаритмические средства (№№ 27- 29), противотуберкулезные средства (№ 12,19-23); антибиотики (№ 25 и 26) и другие препараты широкого спектра деист- вия не оказывают мешающего действия на результаты определения новокаинамида предлагаемым способом. Чрезвычайно важно, что возможно определение новокаинамида в присутствии других антиаритмических средств.

Изобретение иллюстрируется примерами конкретного выполнения.

П р и м е р 1. Построение градуировоч- ной характеристики для количественного фотометрического определения больших количеств новокаинамида.

Точную навеску субстанции сухого препарата новокаинамида (0,0250 г) помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и рас- творяют в дистиллированной воде. Стандартный раствор содержит 1 мг/мл новокаинамида, рабочий раствор содержит 100мкг/мл новокаинамида. Для построения градуировочной характеристики в мерные колбы вместимостью 25 мл помещают по 10-15 мл буферного раствора рН 4,0, затем 0,1 мл (Юмкг), 0,3мл (ЗОмкг), 0,5мл (50мкг), 0,7мл (70мкг), 1,0мл (100мкг) рабочего раствора новокаинамида с С 100мкг/мл, при- бавляют в каждую колбу 0,1мл 0,2%-ного раствора п-ДМАКА и 3 мл М раствора сульфонола и доводят до метки буферным раствором рН 4,0.

Оптические плотности указанных рас- творов измеряли на КФК-2-УХЛ 4,2 в кюветах с толщиной поглощающего слоя I 1 см при А 540 им относительно холостого раствора, в состав которого входят цитратный буферный раствор рН 4,0, 0,1 мл 0,2%-ного раствора п-ДМАКА (4,56-10 5 М) и 3 мл М раствора сульфонола (1.2 М), У0бщ 25 мл.

По полученным значениям оптической плотностью строят зависимость А f(C). За- кон Бугера-Ламбертз-Бера выполняется при концентрации новокаинамида 5-100 мкг/25 мл. или 0,2-4,0 мкг/мл при I 1 см.

П р и м е р 2. Построение градиуропоч- ной характеристики для количественного фотометрического определения малых количеств новокаинамида.

Точную навеску субстанции сухого препарата новокаинамида (0,0250 г) помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и рас- творяют в дистиллированной воде. Стандартный раствор содержит 1 мг/мл новокаинамида, рабочий раствор содержит 10 мкг/мл новокаинамида.

Для построения градуировочной характеристики для малых количеств новокаинамида в колбы на 25 мл вносят по 7-10 мл буферного цитратного раствора рН 4,0, затем 0,1 мл (2 мкг), 0,3 мл(3 мкг), 0.5 мл (5 мкг), 0,7 мл (7 мкг), 1,0мл (10 мкг) раствора новокаинамида с концентрацией 10 мкг/мл. Добавляют по 0,1 мл 0,2%-ного раствора п-ДМАКА и по 3 мл М раствора сульфонола и доводят объем в каждой колбе до метки цитратным буферным раствором рН 4,0. Оптические плотности полученных растворов измеряют на КФК-2-УХЛ4,2 в кюветах с толщиной поглощающего слоя I 5 см при Я 540 нм. Раствор сравнения готовят как в примере 1. По полученным данным оптических плотностей строят зависимость А f(C). Градуировочная характеристика прямолинейна в интервале концентраций 1-10мкг/25мл, или 0,04-0,4 мкг/мл новока- инамидз. Предел обнаружения - 0,04 мкг/мл новокаинамида.

П р и м е р 3. Определение содержания новокаинамида в таблетках.

Анализируемые таблетки лекарственных форм тщательно растирают в фарфоровой ступке. Точные навески 0,5000 г количественно переносят в мерные колбы и растворяют в дистиллированной воде. Алик- воты полученных растворов переносят в колбы на 25 мл и далее проводят определение новокаинамида, как в примере 1. Полученные результаты приведены в табл.8,

Анализ данных, представленных в табл.8, позволяет заключить, что предлагаемый способ определения новокаинамида отличается хорошей воспроизводимостью и правильностью.

П р и м е р 4. Определение содержания новокзинамида в донорской крови.

При подготовке крови к анализу белки крови осаждают трихлоруксусной кислотой,

В пробирки вносят по 2 мл крови доноров, добавляют 30 мкг новокаинамида, тщательно перемешивают. Время контакта препарата с кровью варьировали от 1 мин до20ч. После фиксированного времени контакта осаждают белки 2 мл 30%-ной трихлоруксусной кислоты. Смесь перемешивают стеклянной палочкой и центрифугируют 5- 10 мин на центрифуге при скорости 3000 об/мин. Фильтрат сливают в мерные колбы на 25 мл, добавляют к фильтрату 8-10 мл буферного раствора рН 4,0, 0,1 мл 2%-ного раствора п-ДМАКА, 3 мл 10 М раствора сульфонола и доводят до метки буферным раствором. Полученные смеси фотометри- руют по примеру 1. Содержание новокаинамида определяют по градуировочной характеристике. Результаты определения

новокаинамида в донорской крови приведены в табл.9.

Анализ результатов определения новокаинамида в донорской крови позволяет сделать следующие выводы:

Вне зависимости от групповой принадлежности крови и ее резус-фактора возможно определение новокаинамида предлагаемым способом.

Время контакта новокаинамида может быть достаточно длительным, это не влияет на результаты анализа.

По методу введено-найдено показано, что результаты отличаются правильностью и хорошей воспроизводимостью.

П р и м е р 5. Определение содержания новокаинамида в слюне.

При подготовке слюны к анализу белки, входящие в ее состав, осаждают 96%-ным спиртом-ректификатором.

В мерные пробирки собирают слюну испытуемого, центрифугируют в течение 15 мин при скорости 4000 об/мин (для осаждб- ния твердых остатков слюны). Затем добавляют 2 мл осадителл и центрифугируют еще 7-10 мин. Фильтрат переносят количественно в мерные колбы на 25 мл и добавляют к каждому фильтрату по 10-12 мл буферного раствора рН 4,0 по 0,1 мл 0,2%-ного раствора п-ДМАКА и по 3 мл 10J2 М растворах сульфонола. Смеси доводят до метки буфер ным раствором и фотометрируют как указано в примере 1. Результаты определения новокаинамида у случайно выбранных сотрудников приведены в табл. 10. Как следует из представленных данных, ошибка определения новокаинамида не превышает 10%. Определение новокаинамида в слюне является очень перспективным, так как позволяет легко произвести забор анализируемой биологической жидкости, особенно по сравнению с кровью.

Существенным отличием нового способа определения новокаинаммда является проведение реакции новокаинамид-п-ДМА- КА в присутствии сульфонола в среде цит- ратного буферного раствора рН 2-5. Эти два серьезных изменения привели к тому, что удалось, во-первых, снизить значительно предел обнаружения: в 250 раз по сравнению с прототипом; во-вторых, изменить селективность реакции. Новый способ позволяет определять новокаинамид в присутствии других антиаритмических

средств, что особенно важно, а также в присутствии противотуберкулезных препаратов и антибиотиков широкого спектра действия. В-третьих, расширен диапазон определяемых содержаний новокаинамида

(0,04-0,4 мкг/мл; I 5 см; 0,2-4,0 мкг/мл. I 1 см). Предлагаемый способ впервые позволяет определять малые количества новокаинамида (0,04-4 мкг/мл). Кроме того впервые показана возможность определения новокаинамида в крови и слюне, что чрезвычайно важно для определения наилучшего терапевтического эффекта с учетом индивидуальной чувствительности больного и своевременного поддержания эффективной

лечебной концентрации препарата в организме. Данным способом можно определять и большие количества новокаинамида, что может быть использовано в фармацевтическом контроле. Предлагаемый способ

анализа новокаинамида экспрессен, прост, выполняется на серийной отечественной аппаратуре с использованием выпускаемых в СССР органических реагентов и может быть доступен для выполнения в клинических и биохимических лабораториях лечебных учреждений.

В табл.11 приведено сравнение предлагаемого способа с прототипом и базовым объектом.

Формула изобретения Способ количественного определения новокаинамида путем обработки анализируемой пробы органическим реагентом в

кислой среде с последующим фотометриро- ванием раствора, отличающийся тем. что, с целью упрощения способа, повышения чувствительности и селективности определения, в качестве реагента используют

спиртовой раствор п-диметиламиноко- ричного альдегида о количестве 4,5 -4,5 М и обработку ведут в присутствии сульфонола с концентрацией в реакционной

1-3

смеси 4,0 -10-4,0-10 М при рН 2,0-5,0.

Таблица 1

Сущность изобретения: анализируемую пробу обрабатывают спиртовым раствором п-диметиламинокоричного альдегида в количестве 4,5 .5 10 М в присутствии сульфонола с -.-2 концентрацией 4,0 ,0 М при рН 2,0-5,0 с последующим фотометрированием полученного раствора. 11 табл. сл с

Определение содержания новокаинамида при различной

концентрации п-ДМАКА (Ссульф 3,0 мл М, У0бщ 25мл, КФК -2. , нм )

Определение содержания новокаинамида при различной

концентрации сульфонола (рН 4,0; Сп-дМАКА 0,1 мл 0.2 % -го. Уобщ 25мл, КФК-2, I 1 см)

Установление границ определяемых содержаний новокаинамида

( С П-ДМАКА 0,1 мл 0,2 % -го раствора, Ссульф 3,0 мл -10 М. рН 4,0, У0бщ 25мл)

Таблица 2

Таблица 3

Зависимость значения предела обнаружения от концентрации п-ДМАКА ( рН 4,0, ССульф 3 мл -10 М, У0бщ 25мл, I 5 см)

Зависимость значения предела обнаружения новокаинамида от концентрации сульфонола

( СП-ДМАКА 4,56 М ( 0,1 мл 0,2 %-ный раствор). V06in 25 мл. 1 5 см)

Таблица 6

Зависимость значения предела обнаружения новокаинамида

от рН среды (СП-ДМАКА 0,1 мл 0,2%-го раствора), ССульф 3 мл -ЮМ, /общ 25мл, 5см)

Таблица 4

Таблица 5

дминивии Knwiui iv)- орфали/к1ропмлк п) фенотиазина гилрохпоОпределение содержания новокаинэмидз в таблетках (рН 4,0; С -ДМАКА 0,1 мл 0,2 % -ного раствора, Ссульф 3 мл

- 2-1УХЛ4, 2. I 1 см, Я 540 нм )

1

Таблица 8

Новокаинамид

Vo6m 25 мл, КФК

М.

Таблица 9

Результаты определения новокаинамида в слюне (всем участникам эксперимента введено по 30,0 мкг препарата)

Таблица 10

жения

деляемых

реагент

Фотометрический

0,04 мкг/мл, 1 - 5 см

0,,4 мкг/мл, см 0,2-4,0 мкг/мл, см

Цитратный буфер,- рН 2,0-5,0

Не мешают определению другие антиаритмические средства (см. табл. 7)

0,1 мл 0,2%-ного раствора п-диметиламиноко ричного альдегида - 4,5- , сульфонол - 4,0- Ю 2,

Титриметрический

0,1-0,3 г/80 мл Разбавленная UC1

Тропеолии 00 с метиленовым синим