Штамм @ @ -4994-продуцент сайт-специфической эндонуклеазы Советский патент 1985 года по МПК C12N15/00 C12N9/22 

Изобретение относится к области микробиологии и генной, инженерии J, в частности к получению сайт-специфической эндонуклеазы рестрикции BbrI, аналога рестриктазы Hind III.

Известны микроорганизмы-продуценты эндонуклеаз типа Hind III из рода Haeraophilus D,2.

Известен также штамм Bordetella pertussis, продуцирующий рестриктаЗУ Bpel, которая гидролизует ДНК фагов , Л 989, 641, аденовируса, человека типа 2 и плазмиды pJDB219, так же, как и Hind III Сз.

Однако известные штаты патогенны для человека, требовательны к обогащенные питательньм средам и продуцируют другие типы эндонуклеаз, что затрудняет вьщеление и получение чистого фермента.

Цель изoбpefeния - выявление штамма-продзгцента, непатогенного для человека, нетребовательного к питательным средам и селективно продуцирующего одну сайт-специфическую эндонуклеазу типа Hind III.

Штамм Bordetella bronchiseptica4994 вьщелен от кролика, клонирован по устойчивости к фагам коклюшного И бронхосептикозного микробов и хранится в коллекции научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им.акад.Н.Ф.Гамалеи под регистрационн| м номером 15.

Морфологические признаки. Мел-. кие подвижные овоидной формы коккобациллы размером 0,3-0,,8-0,2 мкм При электронно-микроскопическом исследовании выявлены латеральные жгутики.

Культуральные признаки. Среда Борде-Жангу (картофельноглицериновый агар). Колонии серого цвета, блестящие, с гладкими краями, через 24 ч достигают 1,0 мм в диаметре. Гемолиз не выявлен.

Среда КУА (.казеиново-угольный агар) Колонии серовато-кремового , цвета, вязкой консистенции, с гладкими краями, через 24 ч достигают 1,0 мм в диаметре,Пигмент не выявлен

Пептонный агар Difco. Колонии кремового цвета, вязкой консистенции, через 24 ч достигают 1,5-2,0 мм в диаметре.

Жидкая питательная среда типа Коен-Уилер. Аэробные условия выращивания. Растет при покачивании. Среда

не окрашивается. Микробная взвесь серовато-белого цвета.

Физиолого-биохимические признаки . Усваивает органические соединения. Оптимальная температура роста ЗЗ-Зб С. В качестве источников азота, углерода и энергии используют аминокислоты. .Используют цитраты. Восстанавливают нитраты в нитриты. Характерна быстрая положительная реакция на уреазу (в течение 30 мин при комнатной температуре) .

Содержит водоспецифический бронхосептикозный агглютиноген 12. Культура хранится в лиофильно-высушенном виде.

Штамм Bordetella bronchiseptica4994 содержит эндонуклеазу BbrI, аналог Hind III.

Пример. Лиофилизированный штамм B.bronchiseptica-4994 высевают на среду КУА с 10% крови человека с последующим однократным пересевом в пробирки с той же средой, но без добавления крови. После 24 ч инкубирования при 35С пересевали на матрицы со средой КУА. Микробнме клетки смывали 0,85%-ньм растворе хлорида натрия. Микробную суспензию центрифугировали при 7000 g в течение 20 мин при и промывгши фосфоцеллюлозньм (PC) буфером (10 мМ фосфата калия, рН 7,0,1 мМ ЭДТА, 7 мМ меркаптоэтанола). Затем 10 г биомассы суспендировали в 10 мл PC буфера, содержащего 0,4 М NaCl и 100 мкг/мл лизоцима и разрушали ультразвуком. Обломки бактерий осаждали центрифугированием (100 000 g, 90 мин при 2-4 С) . Надое адочную жидкость разбавляли PC буфером в 8 раз и наносили на колонку голубой сефа- . розы (Blue Sepharose Pharmacia, Швеция), размером 1,,6-10 см, уравновешенную PC буфером с 0,2 М NaCl . Колонку промывали таким же раствором до исчезновения УФ-поглощающего материала в элюате. Адсорбированный материал элюировали 100 мл градиентом 0,2 М NaCl - 2,0 М NaCl с 30% глицерина в PC буфере. Объем каждой фракции составлял 5 мл. Аликвоту из каждой фракции (2 мкл) инкубировали 1 ч при с 1 мкг ДНК фага Л и анализировали электрофорезом в пеле агарозы. Фракции,,расщепляющие ДНК фага Л на Hind Ill-специфические фрагменты объединяли, днализова ги

против PC буфера и наносили на колонку фосфоцеляюлозы (PII Whatmanj Англия) , уравновешенную PC буфером с 0,05 М NaCl, и элюировали 100 мл градиентом 0,05-1,0 М NaCl в PC буфере. Объем каждой.фракции 5 мл. Фракции, содержащие BbrI, определяли так же, как при хроматографии на голубой сефарозе, фермент элюировался в интервале 0,2-0,25 М NaCl. Активные фракции объединили и диалиэовали против PC буфера, содержащего 0,2 М NaCl и 50% глицерина. Полученный препарат (3 мл) имел удельную активность 2000 ед/мл. За единицу активности принимали минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг фага 7 в течение 1ч.

Для идентификации последовательности, узнаваемой BbrJ, проводили гидролиз ею.ДНК фагаЛ, плазмид pBR322 и pSGI (несущей полный геном SVAO). Парадлельно проводили гидролиз указанных тесторных ДНК

эндонуклеазой Hind III, Электрофорез продуктов гидролиза в агароэньЬс и полиакриламидных гелях показал, что BbrI гидролизует каждую из тесторных ДНК на фрагменты, полностью -идентич, ные Hind Ill-специфическим фрагментам. Следовательно, последовательность нуклеотидов, узнаваемая BbrI, идентична последовательности нуклеотидов, узнаваемой Hind III.

В результате обработки Bbrl-фрагментов ДНК , Т4 ДНК-дигазой же, как и в сл:учае Hind Ill-фрагментов ДНК Л, приблизительно 90Z материала превращалось в высокомолекулярную форму. Следовательно, так же, как и в случае Hind Ill-фрагментов, Bbrl-фрагменты ДНК имеют рднонитевые липкие концы.

Таким образом, рестриктаза BbrI имеет сайт узнавания AAG СТТ, идентичный сайту узнавания прототипа Hind III, и может полностью заменить прототип во всех генно-инженерных экспериментах.

Штамм Bordetella bronchiseptica-4994 (коллекция Научно-исследовательского ордена Трудового Красного Знамени института им. акад. И.Ф.Гамалеиt регистрационный номер 15) - продуцент сайт-специфической эндонуклеаэы. (Л с ее