Способ инактивации женского пронуклеуса неоплодотворенной икры костистых рыб Советский патент 1992 года по МПК A01K61/00 C12N15/00 

Изобретение относится к способам разведения, получения мутаций и генной инженерии рыб, и может быть применено в практике экологических, а также экспериментально-эмбриологических исследова- ним.

Известен способ инактивации женского пронуклеуса неоплодотворенной икры костистых рыб путем искусственного получения зрелой икры от самок, подвергшихся гормональной стимуляции, и облучения такой икры высокими дозами рентгена при помощи установок.

Известно, что цитоплазматические факторы наследственности оказывают большое влияние на формирование фенотипа ядер- но-цитоплазматических гибридов костистых рыб путем механического удаления генетического материала из яйцеклеток. Этот способ, принимаемый нами наиболее близок к предлагаемому и заключается в том, что неоплодотворенные яйцеклетки активируют путем помещения их в воду и затем с помощью специальных микрохирургических инструментов механи- чески удаляют из таких икринок женский пронуклеус.

Целью предлагаемого способа является упрощение способа инактивации, повышение процента яйцеклеток с инактивирован- ным пронуклеусом, а также расширение функциональных возможностей способа и повышение надежности метода за счет проведения инактивации пронуклеуса неоплодотворенной икры костистых рыб путем выдерживания икры в воде в течение определенного периода времени.

Для этого, неоплодотворенные яйцеклетки (зрелую икру) костистых рыб выдерживают в воде в течение периода времени, который составляет от 1 - 2 Г0 от момента активации. Т0 - временной интервал между двумя синхронными последовательными делениями при постоянной температуре. Следует отметить, что при обработке икры водой в течение периода времени меньше указанного пронуклеус остается жизнеспособным и мож вт принимать участие эмбриогенеза, при этом обработке водой в течение периода времени больше указанно- го приводит к утере цитоплазмой яйцеклетки способности отвечать на стимул пересаженного ядра в опытах с трансплантацией ядер. В течение же указанного промежутка времени пронуклеус яйцеклетки полностью дегенерирует, что позволяет не

применять предварительного механического удаления пронуклеуса яйцеклеток микрохирургическим способом, приводящим к повреждению большей части используемой в опыте икры и требующим сложных микрохирургических манипуляций.

Пример. В качестве донора яйцеклеток берут половозрелую самку вьюна, инье- цируют хроническим гонадотропином и получают зрелую икру, которую помещают в холодильник при температуре 4° С. Небольшую часть икринок заливают водой и выдерживают в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего производят операцию трансплантации в них ядер бластулы вьюна по описанной ранее методике. Опираясь на данные по нормальному развитию вьюна, полученные ранее, производят фиксацию экспериментального материала через 209 минут после операции. Срезы толщиной 6 мкм окрашивают гематоксилином по стандартной методике, препараты анализируют с помощью светооптического микроскопа с общим увеличением 400х. Установлено, что в данном случае пронуклеус дегенерирует и не принимает участия в эмбриогенезе, то есть он полностью инактивирован. Полученные в результате операции зародыши не отличаются от контрольных (см. табл. 1),

Другие примеры приведены в табл. 1 (последовательность операции та же, что в примере 1. Из таблицы видно, что выявлен интервал, в течение которого пронуклеус яйцеклетки полностью инактивирован.

Формула изобретения Способ инактивации женского пронуклеуса неоплодотворенной икры костистых рыб, включающий активацию неоплодот- аоренной икры путем обработки ее водой, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, повышения процента жизнеспособных яйцеклеток с инактиви- рованным пронуклеусом, расширение функциональных возможностей способа и повышения его надежности, обработку проводят выдерживанием неоплодотворенной икры в воде в течение периода времени, который составляет от одного до двух временных интервалов между двумя последовательными синхронными делениями дробления у используемого вида костистых рыб при постоянной температуре.

Использование: обпасть разведения. получение мутаций, генная инженерия рыб. Сущность изобретения: неоплодотворенные яйцеклетки костистых рыб выдерживают в воде в течение периода времени, который составляет от одного до двух временных интервалов между двумя последовательными синхронными делениями дробления у используемого вида костистых рыб при постоянной температуре СО | о. о о а