(54) ИНГИБИТОР АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТА
Изобретение относится к области молекулярной биологии и генетики, в частности к избирательным ингибито рам активности фермента, и может быть использовано для изучения проце са транскрипции в клетках высших орг низмов. Известен ингибитор - амантин, который подавляет активность П формы ДНК-зависимой РНК - пОлимеразы, ответственный за синтез ДНК - подобных РНК l . До настоящего времени сведений об ингибиторах активности 1 формы ДНК зависимой РНК - полимеразы не имеется . Известно применение селенита натрия - биологии и медицине как Ьешества,- влияющего на митотическое деление в процессе развития, в частности в метафазе и анафазе. Введение селенита натрия вызывает уменьшение митотической активности. Селенит нат рия ингибирует рост клеток, обладает противоокислительной активностью и антирадикальными свойствами. Кроме того, селенит натрия влияет на дыхательную цепь клеточных мембра на процессы окисления и гидроксилиро вания стероидов, лекарственных соединений и пестицидов4 Селенит натрия применяется также для лечения беломышечной болезни, Некроза печени и эксудативного диатеза цыплят. Цель изобретения - применение натрия NOjSeOjB качестве избирательного ингибитора активности 1 формы ДНК-зависимой РНК - полимеразы, катализирующей в клетке высших организмов синтез рибонуклеиновых кислот (РНК). Пример. Из развивающихся зародышей костистой рыбы вьюна (misgordHuS )получают зрелую икру, оплодотворяют и определяют стадии развития по Нейфаху. По достижении нужной стадии зародыши (бластодермы отделяют от желтка Затем чистые бластодермы гомогенизируют в вуфере, содержащем и,О5 М ТрисЦСе(рН 7,4) 0,,jH 0,25М сахарозы. -Гомогенат центрифугируют 10 мин при 1500g. Осадок несколько раз промывают тем же буфером, чистоту выделения ядер контролируют микроскопически. Реакционная смесь для определения РНК-полимеразной активности ядер содержит в объеме 0,125 мл следующие ингредиенты Трис ИСе. - 80 мм РН 8, ДТТ - 1 №1, ЭДТА - 1 мм по 0,2 мм ГТФ ЦТФ, ГТФ и УТФ, м МЛТФ, 1,2 MR кюри С 14 АТФ 582т G/mwoC Ameretiorrt, Eng-eand % ядра из расчета 50 мкг по ДНК, Реакция проводится в условиях высокой (320 мм (КН4)504 ,2) или низкой. (13 MMMg-ce) ионной силы. Добавляют специфический ингибитор; П формы фермента из расчета 0,5 мкг/, /пробу и селенит натрия (концентрация NctjjS&OjOT 4 до 40 мм/пробу) . . Инкубацию проводят при в течение 30 минут. Реакцию останавливают перенесением проб в.ледяную баню и добавляют холодную ТХУ с пирофосфатом натрия до конечной концентрации 10% и 0,5% соответсвенно. бсадки собирают и отливают 5%-ным ТХУ на нитроцеллюлозных фильтрах (АУФС, ЧССР),затем просчитывают в толуоловом сциитилляторе на счетчике (интертехник 5Ь ЗО) , В результате -эксперимента обнаруже но свойство селенита натрия оказывать Селективное (избирательное) действие на активность 1 формы ДНК-завиСИМОЙ РНК-полимеразы, катализир51ощей1 в клетке высших организмов синтез рибонуклеиновых кислот (РНК). Данные действия селенита натрия на активность 1 формы ДНК-зависимой РНК-полимеразы ядер приведены в таблице 1 (в имп/мин на 50 мкг ДНК за 30 мин). Таким образом, как видно из таблицы 1 , уровень включения метки в
2600
1 3600
14 3600
15 2100
16 3900
17 3600
18 4100
25 2000
Таблица
1400 1300 1000 1200 1600 1600 1800 800 РНК за исследованный период развития удиплоидных ядер в бесклеточной системе синтеза РНК при внесении в инкубационную среду экзогенного селена (4 мм/пробу) резко уменьшается по сравнению с контролем. Данные действия селенита натрия на активность П формы ДНК-зависимой РНК - полимеразы ядер приведены в таблице 2 ( в имп/мин на 50 мкг ДНК эа 30 мин). Из таблицы 2 видно, что селенит натрия не оказывает заметного действия на активность П формы ДНК-зависимой РНК -полимеразы ядер вьюна на всех изученных этапах развития. Оказывая ингибирующее действие только на активность 1 формы ДНК-зависимой РНК-полимеразы, селенит натрия является Необходимым веществом для изучения как цикла синтеза рибосомных РНК в высших организмах, так и в качестве транскрибируюшего контроля биохимических процессов. ; Свойство селенита натрия избирательно ингибировать активность 1 формы ДНК-зависимой РНК-полимеразы, ответственной за синтез рибосомной РНК, дает возможность применить это соединение в качестве специфического ингибитора, что, в свою , дает Исследователям в области молекулярной биологии новый тест -метод для изучения процесса транскрипции в клетках высших организмов. Формула изобретения Применение селенита натрия (NOgSetJ) в качестве иэвирательного ингибитора активности 1 формы ДНК-зависимой РНКполимеразы.
Таг5лица2 - 1сточники информации; принятые во внимание при экспертизе: 1. Progress in Nucte-ic Ac-id Re search and mote си tar ,13,93.
