Стабилизирующий состав для получения лиофилизированных препаратов на основе культурального вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей Советский патент 1992 года по МПК C12N7/00 A61K39/125 

Изобретение относится к вирусологии и биотехнологии и может быть использовано для получения сухих вирусных препаратов методом лиофилизации.

Известны стабилизирующие добавки, используемые для лиофилизации культу- ральных суспензий вирусов и живых культу- ральных вакцин в виде композиций, состоящих из пептона, белков и углеводов. Например, для стабилизации вирусной вакцины против чумы плотоядных использовали пептон и лактозу, в качестве наполнителя при высушивании вакцины против болезни Тешена свиней использовали пептон, сахарозу и желатозу, для стабилизации живой коревой вакцины - сорбит и желатозу.

Недостатком вышеперечисленных составов является то, что они обеспечивают сохранение биологической активности препаратов в течение 1 года при температуре хранения, не превышающей +4°.

Наиболее близким техническим решением по стабилизации культуральных суспензий тогавирусов, выбранным в качестве прототипа, является состав, включающий в себя пептон, или бычий альбумин, или сахарозу с желатином. Недостатком предложенного состава является то, что он рекомендован для получения препаратов, хранение которых осуществляется при температуре не более +4° С и при этом на стадии высушивания наблюдается значительное снижение инфекционной активности порядка 0,8-1,3lg LDso.

Целью предлагаемого технического решения является снижение потерь инфекционной активности вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ), наработанного на культуре клеток, на стадии лио- фильного обезвоживания и последующего длительного хранения при положительных температурах. Поставленная цель достигается тем, что в качестве стабилизатора используется состав, состоящий из пептона желатина и углевода, дополнительно содержащий бычий сывороточный альбумин (БСА) и тиосульфат натрия. В качестве углевода используется мальтоза при следующих соотношениях компонентов (г/л культураль- ной вирусной суспензии):

Мальтоза28-60

Пептон44-100

сл

С

о

ЮЯ&

со

о

,

Желатин10-20

БСА11-25

Тиосульфат натрия1,25-3,0

На фиг. 1 и 2 приведены динамики инактивации вируса ВЭЛ в составе препаратов с различными стабилизирующими составами для температур хранения 37 и 20°С, соответственно.

Подготовка вирусного материала к высушиванию проводилась следующим образом, Выращивание вируса (штаммы ТС-83 и № 230) на культуре клеток проводилось в соответствии с известной методикой. Полученный материал представлял собой поддерживающую питательную среду (на основе среды Игла MEM с добавлением 1- 2% сыворотки КРС), содержащую вирус. Компоненты стабилизирующего состава: пептон, БСА, мальтоза и тиосульфат натрия добавлялись в сухом виде к соответствующему количеству культуральной вирусной суспензии и растворялись в ней при комнатной температуре, после чего к полученной смеси добавлялся желатин в виде 10%-ного водного раствора, подогретого до 30-35° С. Замораживание материала осуществлялось при (-30)-(-40)° С, после чего он выдерживался при этой температуре не менее 2 часов. Высушивание проводилось в течение 18-24 часов в вакууме (,1 мм рт.ст.) при температуре подогрева полок лиофилизатора 40° С. Остаточная влажность полученного препарата при этом не должна превышать 3%. Хранение высушенного материала осуществляется в течение 14 дней при 37° С либо не менее 6 мес при 20° С.

Тестирование инфекционной активности исходного и лиофилизованного вирусного материала, а также его инфекционной активности во время хранения при положительных температурах, проводилось путем титрования на первичной культуре фиброб- ластовэмбриона курицы (ФЭК) под твердым агаровым покрытием.

Примеры стабилизирующих составов, использованных для лиофилизации вируса ВЭЛ, наработанного на культуре клеток.

П р и м е р 1. Компоненты защитной среды, г/л культуральной вирусной суспензии:

Мальтоза60

Пептон100

БСА25

Тиосульфат натрия3,0

Желатин20

П р и м е р 2. Компоненты защитной среды, г/л культуральной вирусной суспензии:

Мальтоза44

Пептон72

БСА18

Тиосульфат натрия2,12

Желатин15

П р и м е р 3. Компоненты защитной среды, г/л культуральной вирусной суспензии:

Мальтоза28

Пептон44

БСА11

Тиосульфат натрия1,25

Желатин10

Для указанных примеров инактивация вирусного материала на стадии лиофильно- го обезвоживания оценивалась путем опре- деления инфекционной активности материала до и после высушивания. Для заявляемого стабилизирующего состава (примеры 1-3) и для приведенных выше условий лиофилизации разница между титрами ис- ходной суспензии и высушенного материала составляла 0,1+ 0,2 Ig БОЕ.

В т;абл. 1 приведены средние значения констант скоростей инактивации вируса ВЭЛ в составе полученного препарата для температур хранения -12, 20 и 37°С.

Для расчета констант скоростей инактивации использовалась модель вида ехр(-КИн Г)(1)

где Кин - константа скорости гибели вируса; Со и С - исходная и текущая концентрация вируса, соответственно: т- время экспозиции. В соответствии с (1) строились линейные регрессии для функции

Т а+Ьт(2)

Тогда коэффициент инактивации: ,303 b(3)

Для определения коэффициентов модели (2) был использован взвешенный метод наименьших квадратов. Модель считалась адекватной, если прямая регрессии проходила через доверительные интервалы используемого набора экспериментальных точек. Рас- чет концентраций вирусов проводился в соответствии с известной методикой, доверительные интервалы определялись для 5%-но- го уровня значимости.

В ходе экспериментальных исследова- ний проводилось сравнение эффективности предлагаемого стабилизирующего состава с известными аналогами и прототипом. Данные приведены в табл.2.

В табл. 3 приведены данные, позволяю- щие сопоставить стабилизирующие свойства защитных сред, приведенных в табл. 2, на стадиях лиофильного обезвоживания и последующего хранения при температуре 20 и 37°С.

Изданных, приведенных в табл. 2, видно, что предлагаемое техническое решение обеспечивает существенное повышение устойчивости вируса ВЭЛ на стадии лиофильного обезвоживания. Предлагаемый стабилизирующий состав позволяет в несколько раз снизить потери биологической активности препаратов при хранении их в диапазоне положительных температур до 37° С.

Наиболее рационально применение данного стабилизатора при производстве живых вирусных вакцин, т.к. его использование обеспечивает выживаемость вирусов на этапе приготовления вакцины и позволяет производить хранение и доставку данной вакцины без применения специальной холодильной техники.

Формула изобретения

Стабилизирующий состав для получения лиофилизированных препаратов на

основе культурального вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей, содержащий пептон, желатин и углевод, отличающийся тем, что, с целью снижения

потерь инфекционной активности в процессе лиофильного высушивания и последующего хранения при положительных температурах, состав дополнительно содержит бычий сывороточный альбумин и тиосульфат натрия, а в качестве углевода в нем используют мальтозу при следующих соотношениях компонентов, г/л культу- ральной вирусной суспензии:

Пептон44-100

Желатин10-20

Мальтоза .28-60

Бычий сывороточный альбумин 11-25 Тиосульфат натрия1,25-3,0

Использование: вирусология. Сущность изобретения: для получения сухих вирусных препаратов используют стабилизирующий состав, который содержит, (г/л культураль- ной вирусной суспензии): мальтоза 28-60; пептон 44-100; желатин 10-20; бычий сывороточный альбумин 11-25, тиосульфат натрия 1,25-3,0.

Т а б л и ц а 1

25

Таблица2

ТаблицаЗ

t/H0e#i( 0#л7(/6ностй fffffff/

,0

Фиг. 1

t/#pe#qt/ff#/fffs af/nt/faoc/лй, fff Ј0Ј//4/t

фиг. 2

в

to

12 ft Т,сут#и

т1r180

су/пни