Способ получения препарата вируса Марбург Советский патент 1993 года по МПК C12N7/00 A61K39/12 

Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано при консервации вирусных препаратов методом лиофилиза- ции для последующего хранения.

Целью изобретения является снижение потерь инфекционной активности препарата при лиофилизации и хранении при положительных температурах, а также увеличение сроков хранения препарата.

Указанная цель достигается тем, что жидкий вирусный материал получают из плазмы крови инфицированных морских свинок, предварительно его осветляют низкоскоростным центрифугированием и перед внесением защитной среды дополнительно очищают от балластных белков до остаточного содержания общего белка в очищенном материале, не превышающего 1,0%.

Далее вводят в жидкий вирусный материал защитную среду с последующей его лиофи-- лизацией. Причем дополнительную очистку жидкого вирусного материала осуществляют гель-хроматографией.

Новыми, отличительными от прототипа, являются следующие признаки способа. Жидкий вирусный материал получают из плазмы крови инфицированных морских свинок и перед внесением защитной среды дополнительно очищают от балластных белков до остаточного содержания общего белка в очищенном материале, не превышающем 1,0%. Причем дополнительную очистку жидкого вирусного материала осуществляют гель-хроматографией.

Сравнение заявляемого способа с известными аналогами показало, что отличи00

о

00

о

ho

со

тельные от прототипа признаки проявляют новое, неизвестное ранее свойство, а именно: дополнительная очистка гель-хроматог- рафией вируса Марбург, содержащегося в плазме крови морской свинки, от балластных белков приводит к существенному повышению термоустойчивости при хранении его в виде лиофилизованных, содержащих защитную среду препаратов. Неочевидность указанного свойства новых признаков способа можно обосновать тем, что до настоящего времени считалось использование плазмы крови инфицированных животных неэффективным, поскольку препараты, полученные на ее основе, обладают низкой те рмоустойчивостью при лиофилиза- ции и хранении. В изобретении экспериментально показано, что при дополнительной очистке гель-хроматографией инфицированной плазмы крови животных от балластных белков получают повышение термостабильности препарата, вследствие чего снижаются потери его инфекционной активности при лиофилизации и хранении при положительных температурах.

На фиг.1 приведена динамика инактивации вируса Марбург в составе различных препаратов при 20°С (где 1, 2, 3, 4, 5 - номера примеров приготовлений препарата); на фиг.2 - то же, при температуре 37°С; на фиг.З изображена гель-хррматограмма процесса очистки вируса Марбург на макропористых стеклах (где 1 - пик, соответствующий выходу основного количества вируса; 2 - пик, соответствующий выходу балластного белка; V- объем очищенного вирусного материала, используемый для приготовления препарата).

Способ реализуется следующим образом.

В работе использован вирус Марбург, полученный, в Белорусском НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ СССР. В качестве исходного материала берут плазму крови инфицированных морских свинок с титром 7,5-8,5 Ig БОЁ/мл, Методы выделения вируса Марбург выбирают из условия сохранения инфекционной активности при обеспечении необходимой степени очистки. Содержание общего белка в очищенном материале определяют по методу Лоури в модификации. Определение потерь биологической активности проводят путем титрования вирусного материала по методу БОЕ на культуре клеток Vero под полужидким агаровым покрытием. Сравнение различных методов показывает, что использование одного из вариантов зонального центрифугирования (осаждение через 30%-ный раствор сахарозы), а также сочетание его с гель-хроматографией .на макропористых стеклах (МПС), модифицированных поливинилпирролидо- ном (ПВП), наиболее эффективно (см. табл.1). Более тонкие и сложные методы выделения чистого вируса, такие как использование высокоскоростного центрифугирования в градиенте сахарозы, а также различные .сочетания методов осаждения, ультрафильтрации, сорбционной хроматографии и дру- гих исследовались, но в дальнейшем не применялись, так как при этом получение чистого вирусного материала сопровождается увеличением трудоемкости, в частности, временных затрат, и, как правило,

приводит к существенным потерям его биологической активности.

: Таким образом, жидкий вирусный материал осветляют низкоскоростным центрифугированием и дополнительно очищают от

балластных белков гель-хроматографией до остаточного содержания общего белка в очищенном материале, не превышающего 1,0%. Для стабилизации выделенного вируса используют защитную среду, ранее применявшуюся для культурального вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей, включающую следующие компоненты в концентрации, мг/мл:

Мальтоза50

Пептон 80 Желатин 10 Бычий сывороточный альбумин 20 Тиосульфат натрия v 2,5

Внесение доба&ок производят сразу по приготовлению вирусной суспензии, очищенной до необходимой степени. Допускается хранение очищенного вирусного материала до внесения стабилизатора при

0°С (тающий лед) в течение 1-2 ч. Выдерживание материала при комнатной температуре более 15-20 мин, а также его замораживание без стабилизатора не рекомендуется, так как это может вызвать значительное падение

биологической активности.

Лиофилизацию проводят на установке LGA-05 (ГДР). Замораживание материала с растворенными в нем защитными добавками проводят в камере лиофилизатора при температуре минус ()°С, после чего его выдерживают при этой температуре не менее 2 ч. Высушивание осуществляют в течение 24 ч в вакууме (Р 0,1 мм рт.ст.) при

температуре подогрева полок лиофилизатора 40°С. Остаточная влажность материала после высушивания не превышает 2,5%. Хранение лиофилизатов осуществляют при 20°С не менее 3 мес и при 37°С не менее 14 сут. Так как для ряда полученных вирусных

препаратов отмечается нелинейный характер инактивации, сравнение заявляемого способа с аналогами и прототипом проводят путем сопоставления потерь биологической активности на стадии приготовления и по истечении контрольных сроков хранения. Определение биотитра вирусного материала до и после высушивания, а также в ходе хранения проводят по методу БОЕ,

Пример 1 (прототип). Кровь инфицированных морских свинок с гепарином (250 ед./мл) центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость (плазму) повторно осветляют при 10000 об/мин в течение 5 мин и добавляют стабилизатор. После растворения защитных добавок смесь перемешивают в течение 5-10 мин, после чего лиофилизируют. .;

Пример 2 (аналог). Из печени инфицированной морской свинки готовят 10% гомогеиат, центрифугируют в течение 10 мин при 2000 об/мин, надосадочную жидкость собирают и еще раз осветляют при 10000 об/мин в течение 5 мин. после чего вносят стабилизатор и полученную смесь лиофилизируют.

Пример 3 (заявляемый способ). Готовят осветленную плазму в соответствии с примером 2. Затем ее наслаивают на 30% раствор сахарозы на STE-буфере (0,1 м NaCi; 0,001 м ЭДТА; 0,01 м трис-НС рН 7,5). Соотношение объемов осветленной плазмы и раствора сахарозы 3:1. Центрифугирование проводят на установке 12-21 Вас- Kman (США) в течение 4 ч при 4° С и 18 тыс. об/мин, Надосадочную жидкость удаляют, осадок ресуспендируют с помощью гомогенизатора Даунса в фосфатном буферном растворе с 0,15 м Nad, рН 7,5 в объеме в 5-10 раз меньшем, чем исходный объем плазмы, В полученный таким образом материал вносят стабилизирующие добавки, растворяют, перемешивают смесь в течение 5-10 мин, после чего лиофилизируют.

При многократном воспроизведении описанной в данном примере процедуры очистки вируса Марбург было установлено, что ее использование позволяет удалить не менее 99,0% балластных белков, содержащихся в. исходном объеме плазмы крови морской свинки с титром 7,5-8,5 д БОЕ/мл, Поэтому проведение дополнительного контроля содержания белка в очищенном материале не требуется.

Пример 4 (заявляемый способ). Выделяют вирус центрифугированием с последующим ресуспендированием в гомогенизаторе Даунса в соответствии с примером 3. Полученный вирусный материал очищают на колонке 0 1x50 см с

ПМС, модифицированными ПВП, марки СМП-Ш-1000, в режиме гель-фильтрации. Уравновешивание и элюцию при этом проводят фосфатным раствором с 0,15 м NaCI, рН 5 7,50, скорость элюции раствора 1 мл/мин. Фракции, содержащие основное количество вируса (первый пик хроматограммы, см. фиг.З), объединяют, а в полученной вирион- ной взвеси растворяют стабилизирующие добавки. Смесь перемешивают в течение 5-10 мин, после чего лиофилизируют. Для данного примера степень очистки вируса от балластных белков на 1.-2 порядка выше, чем для примера 3. Дополнительного конт5 роля содержания белка в очищенном материале не требуется.

Пример 5 (заявляемый способ), В исходной осветленной плазме определяют содержание белка по Лоури. Берут конкрет0 ный начальный объем плазмы и готовят из него очищенный материал в соответствии с примером 3. Затем к этому материалу до- бавляют рассчитанное количество исходной осветленной плазмы, чтобы суммарное ко5 личество белка в полученном жидком материале составляло 2-3% от количества, имевшегося в начальном объеме осветленной плазмы. Вносят стабилизирующие добавки, растворяют, перемешивают смесь в

0 течение 5-10 мин, после чего лиофилизируют, Значение титров биологической активности препаратов на стадиях приготовления и при хранении для вышеуказанных примеров приведены в табл.2. В табл.3 при5 ведены суммарные значения потерь инфек- ционности данных препаратов при высушивании и последующем хранении в течение 14 сут при 37°С и в течение 3 мес при 20°С. Из данных, приведенных на

0 фиг.1, 2, а также в табл.2 и 3, следует, что препараты, приготовленные в соответствии с примерами 3 и 4 (по заявляемому способу) более термоустойчивы, чем в прототипе и аналогах (примеры 1 и 2). Их отличает повы5 шенный по сравнению с исходной плазмой крови титр при меньших, чем для других способов, потерях биологической активности при высушивании и последующем хранении. При этом четко прослежива0 ется закономерность повышения по сравнению с прототипом стабильности лиофилизированных препаратов при увеличении степени очистки вирусного материала от балластных белков. Этот эффект

5 начинает наблюдаться, когда содержание общего белка в очищенном материале перед внесением стабилизатора не превышает 1,0% от количества, имеющегося в исходном объеме плазмы. Однако степень очистки, соответствующая наличию в жидком вирусном

материале 2-3% балластных белков от суммарного количества, имевшегося в исходном объеме плазмы, уже не обеспечивает повышенной термоустойчивости препарата вируса Марбург при его хранении при положительных температурах (пример 5), Устойчивость вирусных препаратов, приготовленных в соответствии с заявленным способом, к воздействию положительных температур (20 и 37°С) позволяет широко применять этот способ в вирусологической практике для конверсации вируса Марбург и его последующего хранения без применения низкотемпературного холодильного оборудования. Кроме того, как видно из фиг.1 и 2, препараты, полученные из высококачественного материала (пример 4), имеют в отличие от других динамику инактивации, по характеру близкую к линейной. Данное качество, а также высокая стабильность вирусного материала позволяют использовать этот способ

для получения реперных (стандартных) образцов, наличие которых гарантирует качественное проведение экспериментов при вирусологических исследованиях. Формула изобретения

1. Способ получения препарата вируса Марбург, включающий получение вируссо- держащего материала, осветление его ценгрифугированием с последующей очисткой в градиенте сахарозы, отличающийся тем, что жидкий вируссодержащий материал получают из плазмы крови инфицированных морских свинок, дополнительно очищают

от балластных бел ков до содержания общего белка не более 1,0%, смешивают с защитной средой и лиофилизируют.

2. Способ по п.1., отличающийся тем, что дополнительную очистку жидкого вируссодержащего материала осуществляют гель-хроматографией.

Использование: вирусология. Сущность изобретения: жидкий вирусный материал получают из плазмы крови инфицированных морских свинок, предварительно его осветляют низкоскоростным центрифугированием и дополнительно очищают от балластных белков гель-фильтрацией до остаточного содержания общего белка в очищенном материале, не превышающего 1,0%. 1 з.п.ф-лы, 3 табл., 3 ил. ел с

Т а б л и ц а 1 Сравнительная оценка методов выделения и очистки вируса Марбург.

Приводится по результатам не менее трех независимых экспериментов.

Таблица2

Значение титров биологической активности препаратов, на стадиях приготовления и хранения .

Примечание: Исходный материал был наработан на одной партии животных.

В таблице приведены средние значения титров по трем независимым определениям.

Для лиофилизатов указаны значения титров, приведенные к единице исходного объема вирусного материала.

ТаблицаЗ Данные о потерях биологической активности препарата при лйофилизации и хранении

Фмг-f

Продолжение табл, 2

--. 5

- i

V 2.

Врсия хранения, лес.