СТАБИЛИЗИРУЮЩИЙ СОСТАВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ КОНЪЮГАТА АНТИИММУНОГЛОБУЛИНА G И ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА Российский патент 1998 года по МПК G01N33/531 A61K39/395 G01N33/535 C12Q1/28 

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии и может быть использовано для получения стабильных форм иммунобиологических препаратов, сохраняющих свои специфические характеристики в течение длительного времени.

Известны способы получения стабилизирующих составов конъюгатов на основе белка A и антивидовых иммуноглобулинов [1, 2, 3]. Составы стабилизаторов включают углеводы в виде сахарозы или лактозы, аминокислоты и БСА.

Недостатком данных стабилизирующих составов является то, что они повышают термостабильность препаратов не более, чем на 60% и таким образом не дают возможность сохранять препараты в течение 1 года. При использовании глюкозы или лактозы в качестве углеводного компонента стабилизатора для получения конъюгатов специфическая активность препаратов снижается уже на первой стадии замораживания - оттаивания на 35-40%.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является стабилизирующий состав для получения лиофилизированных препаратов на основе белка A и пероксидазы хрена (КГ БА:ПХ), включающий сахарозу (1,3 - 6%, пептон 4 - 12% и фосфатно-солевой буфер (ФСБ) остальное [4].

Недостатками данного стабилизатора является то, что он хорошо сохраняет препарат КГ БА:ПХ, но не полностью предохраняет конъюгат антииммуноглобулина G и пероксидазы хрена (КГ анти- IgG:ПХ) на стадии лиофильного приготовления, а также не обеспечивает сохранение специфического узнавания иммуноглобулинов после продолжительного хранения сухого препарата при положительных температурах.

Поставлена задача создания стабилизатора такого состава, который обеспечивал бы сохранение биохимических свойств препарата КГ анти-IgG:ПХ в процессах лиофильного высушивания, последующего хранения и регидратации при комнатной температуре.

Поставленная задача решается тем, что стабилизирующий состав для получения лиофилизированных препаратов на основе конъюгата антииммуноглобулина G и пероксидазы хрена, включающий гидролизат протеина, сахарозу, фосфатно-солевой буфер и бактериостатик, согласно изобретению, дополнительно содержит бычий сывороточный альбумин, ЭДТА (трилон Б) и хлористый калий при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Бычий сывороточный альбумин - 0,1-3,0
Сахароза - 1,0-10,0
Гидролизат протеина - 1,0-5,0
Хлористый калий - 2,0-8,0
ЭДТА (трилон Б) - 0,03-0,2
Бактериостатик - 0,01-0,02
Фосфатно-солевой буфер - Остальное
Причем в качестве гидролизата протеина используют пептон или желатин, а в качестве бактериостатика - мертиолят.

Сравнение заявляемого стабилизирующего состава с известными аналогами показывает, что отличительные от прототипа признаки проявляют новое, неизвестное ранее свойство, а именно полное сохранение активности препарата КГ анти-IgG: ПХ на стадии лиофилизации и увеличение по сравнению с прототипом и другими аналогами срока его ранениями при положительных температурах как в сухой форме, так и в регидратированном состоянии, что свидетельствует о состоянии предлагаемого технического решения критерию "изобретательский уровень".

Такое сохранение активности конъюгата, вероятно, обусловлено следующими причинами. Во-первых, гидролизат в отличие от нативного протеина содержит короткие пептиды, которые значительно легче и проще вступают во взаимодействия как с гидрофильными, так и с гидрофобными группами на поверхности конъюгата в отличие от громоздких полимерных исходных молекул протеинов. Во-вторых, введение ЭДТА - в форме его растворимой соли трилона Б - известной своими хелатирующими свойствами, защищает геминную группу пероксидазы хрена от повреждающих взаимодействий с ионами тяжелых металлов. В этих взаимодействиях активные ионы металлов замещаются на пассивные к обмену ионы калия при введении соли KCl.

Пример 1. Технология приготовления стабилизирующего состава для получения лиофилизированных препаратов.

Сначала приготавливают гидролизат протеина путем высокотемпературного расщепления 10%-ного раствора пептона по ГОСТ 13805-76 [5] или желатина пищевого по ГОСТ 11293-78 [6] (pH = 7,0) при 135^oC в течение 3,5 ч. Гидролизованные пептон и желатин характеризуют по аминокислотному составу, вязкости, а фракционный состав характеризуют методами гель-фильтрации и криоскопии.

Компоненты стабилизатора (сахароза, БСА, гидролизат протеина и KCl) растворяют в фосфатно-солевом буфере при нагревании до 40^oC при перемешивании до полного исчезновения осадка. Ко всей массе раствора добавляют требуемое количество трилона Б. В качестве бактериостатика используют мертиолят в количестве 0,01%.

Полученный состав фильтруют через стеклянный фильтр, а затем через фильтр "Millipor" с размерами пор 0,45 мкм.

Фильтрат охлаждают в снежной бане и добавляют в него при перемешивании раствор препарата КГ анти-IgG: ПХ, достигая разведения в 500 - 1000 раз в зависимости от титра конъюгата, определяемого в прямой реакции ИФА со стандартными иммуноглобулинами.

Препарат разливают в ламинарном шкафу по 0,2 мл во флаконы объемом 5 мл, закрывают резиновыми пробками и размещают в металлические кассеты для замораживания. Замораживание препарата во флаконах проводят при температуре прилавка - 60^oC в течение 10-12 ч.

Замороженный препарат во флаконах переносят в сублимационную камеру лиофильной установки TG-50, полки которой охлаждены до минус 35^oC. Температуру препарата на стадии сублимационного обезвоживания поддерживают ниже температуры его стеклования (-30^oC). Средняя скорость нагревания материала на этапе досушивания составляет 6^oC/мин, время выдерживания при 27^o составляет 10 ч.

Лиофильно высушенный препарат имеет остаточное содержание воды около 1,0 - 2,0 мас.%. Определение проводят по методике [7]. Флаконы с препаратом укупоривают под вакуумом.

Активность конъюгата контролируют на всех этапах приготовления сухой формы: при розливе, замораживании и после лиофилизации. В качестве ИФА тест-системы используют специально отобранные из одной качественной партии комплекты "РекомбиБест анти - ВИЧ 1+2". ИФА выполняют в соответствии с Инструкцией применения указанной тест-системы.

Для обоснования количественного содержания компонентов в стабилизирующем составе приготовлены вышеописанным способом варианты предлагаемого состава (1-6) и состав-прототип (7). Данные приведены в табл. 1.

Пример 2. Исследование сохранения активности конъюгата анти-IgG:ПХ на стадии лиофилизации.

Проведены сравнительные исследования по сохранению активности препарата, содержащего заявляемый стабилизирующий состав с разным количественным содержанием компонентов (составы 1-6) или использующего стабилизатора состав-прототип (состав 7). Данные приведены в табл. 2.

Результаты показывают, что наиболее устойчивыми при замораживании и обезвоживании являются варианты препарата с составами 1 и 2, в одном из которых содержится оптимальное количество гидролизата, а в другом - желатины.

Как следует из результатов табл. 2, все составы обеспечивают сохранение активности конъюгата на стадии лиофильного приготовления и в пределах точности постановки ИФА отличия статистически незначимы.

Пример 3. Исследование активности препарата, содержащего разные варианты стабилизирующих составов, в процессе хранения
Для проверки эффективности действия стабилизаторов при хранении препаратов при положительных температурах закладывают в термостаты 30 флаконов с конъюгатом анти-IgG:ПХ, имеющем различные варианты составов стабилизаторов, и хранят указанные препараты при температуре 4 и 37^oC. Результаты приведены в табл. 3. Активность конъюгата анти-IgG:ПХ при хранении определяют в % от сухой формы этого препарата, хранившегося при -20^oC ( σ = ± 5%).

Результаты анализа табл. 3 показывают, что при хранении препарата при 4^oC в течение 6 мес предлагаемый стабилизирующий состав (N 1 и N 2) имеет более высокие характеристики сохранения препарата, чем состав-прототип. Характеристики становятся статистически значимыми при хранении препарата 2 мес при 37^oC. С увеличением времени хранения препарата преимущества заявляемого стабилизатора становятся еще более очевидными.

Следует отметить, что нижние концентрации компонентов стабилизатора определяются минимальной концентрацией гидролизата протеина и сахарозы, необходимых для формирования препарата в форме таблетки с равномерно распределенными порами. Суммарную концентрацию белка и сахарозы подбирают не менее 5%. Верхний предел концентрации нативных протеинов ограничивается их растворимостью в ФСБ.

Минимальная концентрация ЭДТА недостаточно надежно защищает ион железа от примесных ионов в растворе препарата, а максимальная концентрация обеспечивает избыток хелатирующего агента, который связывает частично и активное железо.

Таким образом, экономическая эффективность применения предлагаемого изобретения состоит в следующем. Стабилизирующий состав (1 и 2) на основе гидролизата протеина, сахарозы и ЭДТА (табл. 2) позволяет лиофильно высушивать конъюгат анти-IgG:ПХ без потери активности. При хранении конъюгата анти-IgG:ПХ при 37^oC в течение 10 мес заявляемый стабилизирующий состав (табл. 3) обеспечивает сохранение исходной активности на 80%, а прототип - на уровне 50% от исходной активности. Таким образом, по сравнению с прототипом предложенный стабилизирующий состав снижает потери специфической активности препарата в полтора раза при хранении его длительное время (10 мес и более).

Промышленная применимость. Изобретение может быть использовано в биотехнологии, медицине и ветеринарии при приготовлении иммунобиологических препаратов.

Источники информации
1. Патент США N 4504579, кл. C 12 Q 1/28, C 12 N 9/96, опубл. 19/6 г. (аналог).

2. Воробьева М.С., Шаламберидзе А.Г., Канев А.Н. и др. Вопросы вирусологии. - 1992, N 2.

3. Naofumi Hanafusa. - Contributions from the Institute of Low Temperature Science. Ser. B, 1972, N 17, p, 1-38 (аналог).

4. Патент Российской Федерации N 2046342, кл. G 01 N 33/535, C 12 N 9/96, опубл. 1995 г. (прототип).

5. ГОСТ 13805-076. Пептон ферментативный. Госстандарт СССР, 1976.

6. ТУ 11293-78. Желатин пищевой. Госстандарт СССР, 1978.

7. МИ 123. 39. 002-88. Методика определения остаточной влажности малых количеств материала. - 1988. 7 с.

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии и может быть использовано для получения стабильных форм иммунобиологических препаратов, сохряняющих свои специфические характеристики в течение длительного времени. Стабилизирующий состав включает гидролизат протеина, сахарозу, фосфатно-солевой буфер, бактериостатик, бычий сывороточный альбумин, ЭДТА (трилон Б) и хлористый калий при следующем соотношении компонентов, мас.% : бычий сывороточный альбумин 0,1 - 3,0; сахароза 1,0 - 10,0; гидролизат протеина 1,0 - 5,0; хлористый калий 2,0 - 8,0; ЭДТА (трилон Б) 0,03 - 0,2; бактериастатик 0,01 - 0,02; фосфатно-солевой буфер остальное. В качестве гидролизата протеина используют пептон или желатин, а в качестве бактериостатика - мертиолят. Стабилизатор обеспечивает сохранение биохимических свойств препарата конъюгата анти-IgG и пероксидазы хрена в процессах лиофильного высушивания, последующего хранения и регидратации при комнатной температуре. 1 з. п. ф-лы, 3 табл.

1. Стабилизирующий состав для получения лиофилизированных препаратов на основе конъюгата антииммуноглобулина G и пероксидазы хрена, включающий гидролизат протеина, сахарозу, фосфатно-солевой буфер и бактериостатик, отличающийся тем, что он дополнительно содержит бычий сывороточный альбумин, ЭДТА (трилон Б) и хлористый калий при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Бычий сывороточный альбумин - 0,1 - 3,0
Сахароза - 1,0 - 10,0
Гидролизат протеина - 1,0 - 5,0
Хлористый калий - 2,0 - 8,0
ЭДТА (трилон Б) - 0,03 - 0,2
Бактериостатик - 0,01 - 0,02
Фосфатно-солевой буфер - Остальное
2. Состав по п.1, отличающийся тем, что в качестве гидролизата протеина используют пептон или желатин, а в качестве бактериостатика - мертиолят.