СТАБИЛИЗИРУЮЩИЙ СОСТАВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕФЕРЕНС-СЫВОРОТОК, СОДЕРЖАЩИХ IGM-АНТИТЕЛА Российский патент 1999 года по МПК A61K39/395 

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии и может быть использовано для получения стабильных форм иммунобиологических препаратов, сохраняющих свои специфические характеристики в течение длительного времени. В частности изобретение касается стабилизирующих составов для изготовления референс-сывороток и/или панелей сывороток, содержащих антитела IgM к вирусным антигенам.

Сыворотки с нормированным уровнем антител IgM, сохраняющие этот уровень неизменным в течение не менее 2 лет, необходимы для ранней диагностики ряда особо опасных вирусных инфекций, например гепатита A и ВИЧ, т.к. они нарабатываются в крови инфицированных в среднем на 2 - 3 недели раньше, чем IgG-антитела.

Действующее начало положительной сыворотки - специфические антитела (иммуноглобулины, например IgM или IgG). Стабилизирующий состав должен, во-первых, способствовать сохранению активности антител, во-вторых, предотвращать появление ложноположительного сигнала за счет неспецифической сорбции компонентов сыворотки. Белковые компоненты положительной сыворотки являются защитной средой для специфических антител, одна они не обеспечивают полного сохранения активности антител при лиофилизации и хранении.

Известны стабилизирующие составы для получения лиофилизированных препаратов положительных сывороток крови, включающий углеводы, например сахарозу и глюкозу (Подольский М.В. Высушивание препаратов крови и кровезаменителей. М. : Медицина, 1973, с. 101-102).

Однако такие стабилизирующие составы в составе указанных препаратов затрудняют достижение заданной влажности препаратов (1-3%) в процессе их лиофильной сушки, требуют специальных режимов досушивания, что значительно усложняет технологический процесс получения препарата. Кроме того, такие стабилизаторы не обеспечивают длительное хранение сухих препаратов при положительных температурах, в частности они не обеспечивают сохранение сигналов в иммуно-ферментном анализе (ИФА).

Известен стабилизирующий состав для получения лиофилизированных контрольных положительных сывороток крови на IgG-антитела к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ-1), включающий пептидные и/или смесь пептидных и углеводных компонентов (Экспериментально производственный регламент. Тест-система иммуноферментная для выявления антител к вирусу иммунодефицита человека "Рекомбинат ВИЧ". - НПО "Вектор", Новосибирск , 1988, с. 1 - 7). В качестве пептидных компонентов используют отрицательную сыворотку крови человека, не содержащую специфические антитела к ВИЧ - 7% и сахарозу - 4,7%.

Однако такие стабилизаторы не обеспечивают длительное хранение сухих препаратов, содержащих IgG- и IgM-антитела, при положительных температурах, в частности они не обеспечивают сохранение сигнала в иммуноферментном анализе (ИФА).

Известен стабилизирующий состав для получения лиофилизированных положительных контрольных сывороток, содержащих IgG-антитела (патент РФ N 2011202, кл. G 01 N 33/531, опубл. 1994), включающий пептидные и/или смесь пептидных и углеводных компонентов, этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) и воду, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Этилендиаминтетраацетат - 0,02 - 0,22
Пептидные и/или смесь пептидных и углеводных компонентов - 1,0 - 20,0
Вода - Остальное
Основным недостатком данного стабилизирующего состава является то, что он разработан для стабилизации IgG-антител в сыворотках крови, которые по своим структурным и физико-химическим характеристикам значительно отличаются от IgM-антител. Это обусловлено тем, что IgM-антитела имеют в 5 раз более высокую молекулярную массу, чем IgG-антитела. Соответственно структура IgM менее упорядочена и менее устойчива в отношении воздействия температуры, pH, физических стрессов и химических агентов. Следовательно, и состав стабилизатора, и режим лиофилизации будут существенно отличаться.

Наиболее близким техническим решением (прототипом), является человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) и хлорид натрия в буферном растворе, N-ацетил триптофанат, натрий каприлат, азид натрия и фосфатный буферный раствор (международная заявка (WO) N 90/11091, кл. A 61 K 39/395, опубл. 04.10.90), при следующем количественном соотношении компонентов:
ЧСА в количестве от 2,5% (w/v) до 5% (w/v);
хлористый натрий - 270 мМ;
N-ацетил триптофанат 2 - 4 мМ;
натрий каприлат 2 - 4 мМ;
азид натрия 0,1%;
фосфатный буфер (от 8 мМ до 20 мМ натрий фосфат) при pH 6,8 - 7,4;
или трометаниновый буфер (от 5 мМ до 100 мМ трометанина) при pH 8,0-10,0.

Данный стабилизатор предназначен для инъекционных препаратов в жидкой и сухой форме, содержащих IgM-атитела в количестве около 5 мг/мл. Предлагаемый состав увеличивает стабильность IgM-антител в растворах. Полученный раствор может быть лиофилизирован для получения сухой формы, более устойчивой к воздействию физических и химических (повреждающих) факторов. Он разработан для предотвращения агргегации молекул IgM и сохранения биологических свойств препаратов для инъекций.

К основным недостаткам прототипа следует отнести следующие:
1. Нежелательное использование в качестве бактерицидной добавки азида натрия. Для сухих биологических препаратов, приготовленных методом лиофилизации, Советом экспертов ВОЗ не рекомендуется использовать азид натрия, т. к. он обладает высокой летучестью и удаляется из препаратов в процессе лиофильной сушки.

2. Отсутствие экспериментальных данных, подтверждающих сохранение качества (годности) жидких или сухих препаратов в течение 2-х лет. На основании приведенных в патенте результатов по термической деградации инъекционных форм, содержащих IgM-антитела, можно оценить срок их годности не более 1 - 1,5 лет.

3. Использование в качестве компонента стабилизатора ЧСА для референс-материалов экономически невыгодно по сравнению с другими сывороточными альбуминами: бычий сывороточный альбумин (БСА) или лошадиный сывороточный альбумин (ЛСА), которые выполняют те же функции по стабилизации протеинов, что и ЧСА, в 3 - 5 раз дешевле.

Подводя итог изложенному выше, следует отметить, что используемые в известных источниках научно-технической и патентной информации стабилизирующие составы не могут быть использованы при изготовлении референс-сывороток с нормированным уровнем IgM-антител, вследствие чего требуется разработка составов-стабилизаторов для получения препаратов со специфическими характеристиками, остающимися неизменными в течение длительного времени в соответствии с требованиями комитета экспертов ВОЗ к референс-материалам.

В основу настоящего изобретения поставлена задача создания такого стабилизирующего состава, который обеспечивал бы сохранение специфических характеристик IgM-антител в референс-сыворотках в течение длительного времени (не менее 2 лет) при хранении их при температуре (+4 ± 2)^oC.

Указанная задача решается тем, что в стабилизирующем составе для получения референс-сывороток, содержащих IgM-антитела, включающем сывороточный белок, неорганическую соль и бактериостатик, согласно изобретению состав дополнительно содержит этилендиаминтетраацетат (Трилон Б), пептон, сахарозу, отрицательную донорскую сыворотку группы 0(I) и аскорбиновую кислоту, в качестве сывороточного белка используют бычий сывороточный альбумин, а в качестве неорганической соли - хлористый калий, при следующем количественном соотношении компонентов, мас.%:
Бычий сывороточный альбумин - 0,5 - 1,5
Этилендиаминтетраацетат - 0,01 - 0,1
Аскорбиновая кислота - 0,01 - 0,001
Пептон - 0,5 - 2,5
Сахароза - 4,5 - 10,0
Хлористый калий - 0,5 - 1,5
Бактериостатик - 0,01 - 0,15
Отрицательная донорская сыворотка группы 0(I) - Остальное до 100%
В качестве бактериостатика используют мертиолят.

Предлагаемый стабилизирующий состав предназначен для приготовления сухой устойчивой формы сывороток, содержащих IgM-антитела. Большие молекулы IgM состоят из нескольких субъединиц, соединенных слабыми водородными связями. В условиях хранения в закрытом флаконе при постоянных pH и температуре основным повреждающим фактором для молекул IgM являются, по-видимому, перекисные радикалы. Антиоксиданты, направленные на ограничение развития окислительных процессов, увеличивают сохранность IgM-молекул. Таким образом, для увеличения антиокислительной устойчивости сывороток с нормированным уровнем IgM-антител в состав стабилизатора введены аскорбиновая кислота и ЭДТА (Трилон Б). Известно, что ЭДТА блокирует перекисное окисление липидов за счет связывания ионов тяжелых металлов в препарате. Причем в этих взаимодействиях активные ионы металлов замещаются на пассивные к обмену ионы калия из-за наличия в стабилизаторе соли хлористого калия. В то же время аскорбиновая кислота является ловушкой для перекисных радикалов. В этой связи совместное использование таких антиоксидантов, как аскорбиновая кислота и ЭДТА, значительно повышается устойчивость (сохранность) препаратов из сыворотки крови, содержащих IgM-антитела. Кроме того, для стабилизации уровня IgM-антител предлагается использовать белковые компоненты (бычий сывороточный альбумин), которые являются для них защитной средой. Из различных опробованных гидролизатов протеинов наилучшие результаты показал пептон в количестве до 2,5 мас. %. Существенное уменьшение содержания белка в стабилизаторе (относительно прототипа в 2-3 раза) достигается за счет использования углеводов (лучше всего сахарозы в количестве 3 - 6 мас.% и аминокислот или низкомолекулярных продуктов деструкции белков (маленьких пептидов в составе пептона), не обладающих иммуногенной активностью. С позиций физической химии введение углеводов и аминокислот эквивалентно созданию вокруг IgM-молекулы дополнительной защитной оболочки, вытесняющей активную воду из ближайшего окружения молекулы, недоступную для больших молекул альбуминов.

Отрицательная донорская сыворотка крови используется в стабилизирующем составе как разводящий раствор, компоненты которого оказывают дополнительное стабилизирующее действие на приготовляемый препарат за счет высоких антиоксидантных свойств. Кроме того, отрицательная донорская сыворотка выполняет функции буферной системы, обеспечивающей поддержание pH в оптимальном режиме.

При уменьшении количественного содержания ингредиентов предлагаемого состава ниже нижнего предела не обеспечивается необходимый срок хранения референс-сывороток, содержащих IgM-антитела, а увеличение количественного их содержания выше верхнего предела - ограничено значительным увеличением стоимости стабилизирующего состава без существенного повышения срока хранения референс-сывороток.

Пример 1. Приготовление стабилизирующего состава для получения референс-сывороток, содержащих IgM-антитела.

Донорские сыворотки крови группы 0(I), отрицательные на содержание маркеров вирусных инфекций, помещают в емкость, установленную на магнитной мешалке, и смешивают в течение 10 мин при 300 об/мин. Смешанную отрицательную донорскую сыворотку используют для приготовления разводящего раствора. Готовят стабилизирующий состав на 1 л смешанной отрицательной донорской сыворотки группы 0(I). Последовательно растворяя БСА, пептон, сахарозу, KCl, ЭДТА и аскорбиновую кислоту в отрицательной донорской сыворотке крови в следующих количествах: БСА - 12 г, пептон 25 г, сахароза 50 г, KCl 10 г, ЭДТА 1,0 г, аскорбиновая кислота 0,02 г.

Раствор (стабилизирующий состав) доводят до pH 6,8 - 7,1 с помощью 0,1 M NaCl. В качестве бактериостатика вводят мертиолят в количестве 0,01% от массы раствора. Полученный раствор фильтруют, разливают в емкости по 250-500 см³ и используют для разведения иммунной сыворотки, содержащей IgM-антитела, или хранят при температуре 2 - 8^oC в течение не более 1 месяца.

Пример 2. Технология получения референс-сывороток, содержащих IgM-антитела.

Нативные иммунные сыворотки для изготовления сывороток с нормированным уровнем IgM-антител подбирают по результатам скриннинга сывороток пациентов инфекционной клиники в тест-системе "Вектогеп A IgM" на содержание иммуноглобулинов М.

По результатам иммуноферментного анализа (ИФА) отбирают сыворотки для изготовления референс-препаратов с различным уровнем IgM-антител. Иммунную сыворотку (плазму), предназначенную для получения референс-сыоротки, содержащей IgM-антитела, подвергают инактивации прогреванием при температуре (56 ± 2)^oC в термостате в течение 50 - 60 мин.

Реактивную (положительную) сыворотку, содержащую IgM-антитела, каждого номера смешивают с разводящим раствором отрицательной донорской сыворотки группы 0(I) (заявляемый стабилизирующий состав) в соотношении, заданном коэффициентом разведения. Разведение для каждого номера сыворотки осуществляют в емкости объемом 500 см³, установленной на магнитной мешалке в течение 5 - 7 мин.

Готовую (разведенную) стабилизованную положительную сыворотку, содержащую IgM-антитела, разливают в ламинарном шкафу по 0,2 мл во флаконы объемом 5 мл, закрывают резиновыми пробками и размещают в металлические кассеты для замораживания. Замораживание препарата во флаконах проводят при температуре прилавка - 60^oC в течение 10 - 12 ч.

Замороженный препарат во флаконах переносят в сублимационную камеру лиофильной установки TG-50, полки которой охлаждены до минус 35^oC. Температура препарата на стадии сублимационного обезвоживания поддерживают ниже температуры его стеклования (-30^oC).

Средняя скорость нагревания материала на этапе досушивания составляет не выше 4 град/мин, время досушивания при 25^oC составляет 10 часов. Общее среднее время сушки 30 ч.

Лиофильно высушенные препараты имеют остаточное содержание воды от 1,0 до 2,0 мас.%. Определение проводят по методике (МИ 123.39.002 - 88. Методика определения остаточной влажности малых количеств материала. - Новосибирск, ГНЦ ВБ "Вектор", 1988, 7 с.).

Флаконы с препаратом укупоривают под вакуумом.

Пример 3. Данные по хранению препаратов с использованием предлагаемого стабилизирующего состава.

Контроль специфической активности лиофилизованных сывороток с нормированным уровнем IgM-антител, содержащих предлагаемый стабилизирующий состав, проводят в иммуноферментных тест-системах отечественного и зарубежного производства. Результаты контроля приведены в табл. 1.

Как следует из результатов аттестации все препараты идентифицированы как положительные на содержание IgM-антител. Наиболее высокие титры имеют сыворотки NN 3 и 4, а наименее низкие титры - сыворотки NN 1 и 6.

Для проведения испытаний срока годности изготовленные препараты термостатируют (тест термодеградации) при температуре 20^oC в течение 9 месяцев.

Сыворотки после хранения (термостатирования) анализируют в иммуноферментной тест-системе "Мультитест" (Москва). Результаты представлены в табл. 2.

Из результатов испытаний следует, что концентрация анти-HAV IgM в тестированных референс-сыворотках практически не изменилась после хранения в течение 9 месяцев при комнатной температуре.

На основании полученных результатов можно оценить срок годности препаратов с нормированным уровнем IgM-антител по стандартной методике (E.Y.Shalaev, A. N. Kanev. Solid-liquid state diagram of the water glycine-sucrose system. Cryobiology, 1994, vol.31, p. 374-382).

t = 9 мес • 2² = 36 мес
Таким образом, годность препаратов может быть оценена сроком до 3 лет при хранении при 4^oC.

По результатам тестирования на отечественных и зарубежных иммуноферментных тест-системах, а также по результатам теста термодеградации референс-сыворотки с нормированным уровнем IgM-антител были аттестованы Национальным органом контроля (ГИСК им. Л.А.Тарасевича) в качестве референс-материалов - отраслевых стандартных образцов (ОСО).

Промышленная применимость. Изобретение может быть использовано в биотехнологии и медицине.

Стабилизирующий состав может быть использован в биотехнологии и иммунологии. Состав имеет следующее количественное соотношение компонентов, мас. %: бычий сывороточный альбумин 0,5 - 1,5, этилендиаминтетраацетат 0,01 - 0,1, аскорбиновая кислота 0,01 - 0,001, пептон 0,5 - 2,5, сахароза 4,5 - 10,0, хлористый калий 0,5 - 1,5, бактериостатик 0,01 - 0,15, отрицательная донорская сыворотка группы 0(I) остальное до 100%. Стабилизирующий состав обеспечивает сохранение специфических характеристик IgM-антител в референс-сыворотках в течение длительного времени (не менее 2 лет) при хранении их при температуре (+4 ± 2)^oC. 1 з.п.ф-лы, 2 табл.

1. Стабилизирующий состав для получения референо-сывороток, содержащих IgM-антитела, включающий сывороточный белок, неорганическую соль и бактериостатик, отличающийся тем, что состав дополнительно содержит этилендиаминтетраацетат (Трилон В), пептон, сахарозу, отрицательную донорскую сыворотку группы 0(I) и аскорбиновую кислоту, в качестве сывороточного белка используют бычий сывороточный альбумин, а в качестве неорганической соли - хлористый калий, при следующем количественном соотношении компонентов, мас.%:
Бычий сывороточный альбумин - 0,5 - 1,5
Этилендиаминтетраацетат - 0,01 - 0,1
Аскорбиновая кислота - 0,01 - 0,001
Пептон - 0,5 - 2,5
Сахароза - 4,5 - 10,0
Хлористый калий - 0,5 - 1,5
Бактериостатик - 0,01 - 0,15
Отрицательная донорская сыворотка группы 0(I) - Остальное до 100%
2. Стабилизирующий состав по п. 1, отличающийся тем, что в качестве бактериостатика используют мертиолят.