Способ определения инфекционной активности вирусов в процессе хранения Советский патент 1992 года по МПК C12N7/00 

Техническое решение относится к области определения инфекционной активности вирусных агентов методом бляшкообразую- щих единиц (БОЕ) и может быть использовано в биотехнологии и вирусологии.

Известен способ определения инфекционной активности вируса включающий зара- жение культуры тканей исследуемым тогавирусом, инкубирование и нанесение агаровых покрытий с HEPES, рН 7,5-8,0.

После инкубирования подсчитывают число и размеры бляшек.

Недостатком способа является низкая точность определения инфекционной активности вируса. Точность определения инфекционной активности в данном способе зависит от многих факторов: качества питательных сред, физиологического состояния культуры клеток, температурного режима и т.д. Исключить вышеуказанные факторы при определении инфекционной активно« «ь

сти вирусных препаратов, хранящихся в течение длительного времени, по данному способу не представляется возможным.

Известна защитная среда, используемая для хранения вирусов и включающая пептон, лактозу и фосфатный буфер.

Недостатком данной среды является то, что она не может быть использована для длительного хранения вирусов (более 1-2 мес),

Наиболее близким способом определения инфекционной активности вируса методом БОЕ (прототипом) является способ, включающий заражение клеток vero десятикратным разведениями исследуемого препарата. После 60 минутного контакта при комнатной температуре инокулят сливают и монослой заливают полужидким агаровым покрытием, приготовленным на среде Игла МЭМ и содержащим 0,03% агара Difco и 1 % инактивированной сыворотки крупного рогатого скота. Монослой термостатируют при температуре 37° С. Учет бляшек производится через 8-9 суток.

Недостатком способа-прототипа является низкая точность определения инфекционной активности вируса, которая зависит от качества питательных сред, физиологического состояния культуры клеток, температурного режима, срока окраски монослоя.

Целью предлагаемого технического решения является повышение точности определения инфекционной активности вируса в процессе хранения путем исключения зависимости чувствительности клеток от различных факторов: качества питательных сред, физиологического состояния самих клеток, температурного режима культивирования, сроков окраски монослоя.

Указанная цель достигается следующей совокупностью существенных признаков способа. Способ включает разведение ви- руссодержащей суспензии, заражение вирусом монослоя культуры клеток, нанесение агарового покрытия на монослой с последующей инкубацией и учетом количества и размера бляшек. Вируссодержащую суспензию приготавливают в виде референс- препарата, включающего защитную среду и исследуемый вирусный агент. Референс- препарат разливают на отдельные дозы с высокой однородностью содержания вирусного агента в каждом объеме дозы, консервируют, например лиофилизацией, и хранят в течение времени при котором вирус имеет достаточную инфекционную активность с титром не менее 3,0 Ig БОЕ/мл. После этого титрование отдельных доз референс-препа- рат осуществляют одновременно с титрованием исследуемых образцов вирусного

материала и сравнивают значения титров исследуемых образцов со значениями титров доз референс-препарата. Определение разницы титров инфекционной активности

вирусного материала определяют из следующего выражения:

(2)-Tx(1)-Tpn(2)+Tpn(1)+ai(t2-ti), (1) где: Тх - падение инфекционности исследуемого препарата за период времени (Ig

0 БОЕ/мл);

Тх(1) - экспериментальное значение инфекционности исследуемого препарата в момент времени ti (Ig БОЕ/мл);

Тх(2) - то же, в момент времени t2;

5ТрП(1) экспериментальное значение

инфекционности референс-препарата в момент времени ti - (Ig БОЕ/мл);

ТрП(2) - то же, в момент времени t2; ai - линейный коэффициент инактива0 ции референс-препарата (Ig БОЕ/БОЕ мл/дни) в случае, если результаты тестирования референс-препарата описываются моделью вида

y a0+ait (2), где

числа БОЕ/мл;

t - время хранения референс-препарата;

а0 исходный титр референс-препарата.

0В качестве защитной среды референспрепарата используют смесь инозита, лактозы и фосфатного буфера (Na2HP04 12H20) в растворе Хенкса при следующем количественном соотношении компонентов (вес.

5 %):

инозит3,0-10,0

лактоза2,5-7,5

фосфатный буфер (N39HP0412H20) 1,0- 3,0

0раствор Хенкса остальное.

Способ реализуется следующим образом. Перед осуществлением способа приготавливают референс-препарат на основе 1 %-ного гомогената печени морских свинок

5 инфицированных, например вирусом Мар- бурга. Отбор печени морских свинок производят на 6-7 сутки после заражения, при условии 30%-ного падежа взятых в эксперимент животных. Печень морских свинок из0 мельчают на гомогенизаторе Homogenezer type MPW-302 (Польша). К 5 мл 100%-ного гомогената прибавляют 95 мл раствора добавок: в 100 мл раствора Хенкса растворяют (2,5-7,5) г лактозы и (3,0-10,0) г инозита.

5 Полученный раствор стерилизуют автокла- вированием при 121° С 2 часа. Более тонкое измельчение полученного 5%-ного гомогената проводят на гомогенизаторе Melesungen AC type 853202 (фирма B.Braun, ФРГ) при 1500 об/мин двукратно. После

чего рН раствора доводят до 8,01 N раствором NaOH и добавляют (1,0-3,0) г фосфатного буфера (N32HP04 12Н20). При этом рН становится 8,2. Полученный гомогенат разливают по 1 мл автоматической пипеткой Gilson, 1000 во флаконы объемом 10 мл. Флаконы помещают на полку сублимационной установки MFD-0.02 (фирма Эдварде, Англия). Замораживают в течение 5 часов до t°-40° С. Сублимируют 28 часов при отклю- ченном охлаждении полок. Температура продукта в конце сублимации +20° С. Досушивают 30 часов при этой температуре. Вакуум в конце досушивания 90 мк бар. Развакуумирование производят напуском аргона. После лиофилизации флаконы герметично закупоривают и хранят при t -12°C в морозильных камерах бытовых холодильников. Для оценки качества референс-пре- парата первое титрование проводилось после его месячного хранения и далее постепенно 1-2 раза в неделю в течение 1 года (всего 80 определений). Каждое определение по 3-4 повтора. За 6 мес хранения ре- ференс-препарата при С происходит его инактивация на 0,14 Ig БОЕ. За год падение титра составило 0,28 Ig БОЕ, Следует отметить, что инфекционный вирус Марбург гомогенат печени морской свинки без защитной среды теряет свою активность в за- мороженном состоянии в течение 6 мес. 1-1,5 Ig БОЕ/мл, что не годится для тестирования культур клеток. В процессе выбора количественных соотношений компонентов на основе лактозы, инозита и фосфатного буфера. Наиболее интересные данные получены на образцах 1-6. Для сравнения использовалась известная защитная среда (образец 7) на основе пептона, (ГОСТ 13805-76) лактозы и фосфатного буфера (см. таблицу 1).

Из табл. 1 видно, что предлагаемая защитная среда при следующем количественном соотношении компонентов: инозит - 30-100 мг/л; лактоза - 25-75 мг/л; фосфат- ный буфер - 10-30 мг/л обеспечивает минимальное падение биоактивности референс-препарата в процессе его хранения при С в течение 6 мес., что подтверждает существенность выбранных количественных соотношений компонентов защитной среды референс-препарата.

Для определения инфекционной активности исследуемого вируса, например вирус Марбург, его суспензию разводят и заражают монослой клеток vero. Инкуба- цию проводят в течение 1 часа при комнатной температуре, после чего монослой заливают полужидким агаровым покрытием и помещают в термостате на 8-9 суток при

температуре 37° С. После чего окрашивают монослой клеток раствором генцианвиоле- та (0,1 % раствор в 20%-ном этиловом спирте) и подсчитывают негативные колонии. Параллельно с исследуемыми образцами вируса в каждый их день титрования определяют титр референс-препарата по 3-4 повторам и сравнивают значения титров исследуемых образцов вируса со значениями титров доз референс-препарата. Разницу титров инфекционной активности вирусного материала определяют из следующего выражения:

(2)-Tx(1)-Tpn(2)+Tpn(1)+ai(t2-ti)

(расшифровка условных обозначений приведена выше по тексту).

По разнице титров инфекционной активности исследуемого вирусного материала и референс-препарата в разные моменты времени судят о падении инфекционной активности исследуемого препарата за определенный период времени (в Ig БОЕ/мл).

В табл. 2 приведены данные по определению инфекционной активности вируса Марбург методом БОЕ. Расчеты проводились по формуле (1).

Значение биоактивности препарата в каждом примере определялось как среднее из трех независимых определений, осуществленных в одно и то же время. При обработке статистических данных среднеквадратичное отклонение составляет:

-для исследуемых препаратов ,15

-для референс-препарата ,1

Технический эффект от испопьзования предлагаемого способа состоит в более кор ректном сравнении биоактивности препаратов, титрованных в разное время с учетом чувствительности серий культур клеток.

Повышается точность определения, инфекционной активности (не менее чем в 2 раза) за счет уменьшения доверительного интервала в 2 раза. При обработке статье i и- ческих данных дисперсия составляет:

-с использованием референс-препарата ,023

- без использования референс-препарата ,048

Формула изобретения

Способ определения инфекционной зк тивности вирусов в процессе хранения методом бляшкообразующих единиц, включающий разведение вируссодержащей суспензии, заражение монослоя культуры клеток, нанесение агарового покрытия, инкубацию, учет количества и размера бляшек с последующим вычислением титра вируса, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, вируссодержащую суспензию готовят в виде референс-препарата с защитной ередои, представляющей собой смесь инозита, лактозы и фосфатного буфера в растворе Хенкса, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Инозит3-10

Лактоза2,5-7,5

Фосфатный буфер1,0-3,0

Раствор ХенксаОстальное,

заражение монослоя клеток производят дозами с однородным содержанием вируса, хранившимися в течение времени, при котором вирус сохраняет активности не менее 3,0 Ig БОЕ/мл титрование доз референс- препарата осуществляют одновременно с

0

5

титрованием исследуемых образцов, а вычисление титра вируса проводят по формуле

(2)-Tx(1)-Tpn(2)+Tpn(1)+a1(t2-ti), где Тх - падение инфекционное™ исследуемого препарата за период времени ();

Тх(1) - экспериментальное значение ин- фекционности исследуемого препарат в момент времени ti;

Тх(2) - то же в момент времени ta;

ТрП(1) - экспериментальное значение инфекционности референс-препарата в момент времени ti;

Трп(2) - то же в момент времени Т2,

ai - линейный коэффициент инактивации референс-препарата.

Использование: определение инфекционной активности вирусных агентов методом БОЕ, биотехнология и вирусология. Сущность изобретения: предварительно готовят референс-препарат, включающий исследуемый вирус и защитную среду. Препарат разливают на отдельные дозы с однородным содержанием вируса в каждом объеме. Референс-препарат хранят в течение времени, при котором вирус имеет достаточную инфекционную активность с титром не менее 3 Ig БОЕ/мл. Для определения инфекционной активности исследуемого вируса, суспензию этого вируса разводят, заражают монослой культуры клеток, наносят агаровое покрытие, инкубируют и учитывают количество, и размер бляшек с последующим вычислением титра вируса. Параллельно с исследуемыми образцами определяют титр референс-препа- рата и сравнивают значения титров исследуемых образцов вируса со значениями титров референс-препарата. Разницу титров инфекционной активности вирусного материала определяют по формуле

Т а б л и ц а 1 Данные по выбору количественных соотношений компонентов защитной среды

Примеры по определению инфекционной активности вируса Иарбург (lg БОЕ/мл) в процессе хранения

Примечание. Доверительный интервал 95%,

Таблицэ2