Штамм VIRUS JapoNIcI еNсернаLIтIDIS для приготовления диагностических и профилактических препаратов Советский патент 1992 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к медицинской вирусологии.

Известны штаммы вируса японского энцефалита (ЯЭ). используемые для приготовления диагностических и профилактических препаратов (1,2-штяммы Пекин-1 и Накаяма вируса ЯЭ), депонированные в Государственную коллекцию вирусов являютс0

производственными штаммами для разработки диагностических и профилактических препаратов, необходимых для работы в регионах СССР (Дальний Восток), эндемичных для ЯЭ.

Однако эти штаммы характеризуются рядом недостатков: отсутствие широких антигенных связей не позволяет эффективно выявлять антитела к различным вариантам вируса ЯЭ в сыворотках людей и животных в эндемичных районах при использовании диагностических препаратов, приготовленных на основе этих штаммов; для наработки культуральных диагностических и профилактических препаратов на основе этих штаммов необходимо использование дорогостоящих первичных клеток, сред и сывороток вместо экономичных и доступных культур клеток куриного эмбриона, в которых известные штаммы вируса ЯЭ слабо репродуцируются, и, следовательно, препь- раты, приготовленные на основе штаммов вируса ЯЭ в культурах клеток куриного эмбриона, характеризуются слабой антигенной, иммуногенной и протективной активностью. Использование высокопатогенных штаммов вируса ЯЭ для производства диагностических препаратов и профилактических средств требует дополнительных затрат для обеспечения безопасности персонала при работе с вирусом

Целью изобретения является получение штамма вируса ЯЭ, характеризующегося широким спектром антигенных связе й, высокой репродуктивной активностью в культурах клеток куриного эмбриона, низкой нейровирулентностью, обладающего высокими показателями иммуногенной активности, предназначенного для приготовления диагностических и профилактических препаратов (антигенов, иммунных асци- тических жидкостей, культуральной инакти- вированной вакцины), которые могут быть использованы в практике работы ряда арбо- вирусных лабораторий страны для изучения иммунитета среди людей и животных и для идентификации вновь выделенных штаммов вируса ЯЭ в эндемичных регионах, а также для профилактики заболеваний ЯЭ

Поставленная цель достигается путем использования оригинального штамма вируса японского энцефалита клона Ns 3.

Штамм Virus japonic encephalitidis выделен из культур клеток головного мозга мышей-сосунков, хронически инфицированных клоном 33 вируса ЯЭ (3) - штгмма Накаяма, на 422-й день со зня заражения культур с последующим трехкратным клонированием из бляшки.

й

При идентификации штамма вируса ЯЭ с набором иммунных асцитических жидкостей к вирусам, относящимся к различным антигенным группам, установлена его анти5 генная связь со штаммами вируса ЯЭ Пе- кин-1 Джагар 01, Накаяма, ДВК-4.

Штамм вируса ЯЭ хранится в лаборатории генетики арбовирусов Института вирусологии им. Д. И, Ивановского АМН СССР и

10 в Государственной коллекции вирусов под регистрационным номером ГКВ-677. Штамм характеризуется стабильным проявлением биологических признаков. Физико-химические признакиГ

15 Индекс инвазивности - 6,5 Ig ЛДзо. Индекс инактивации дезоксихолатом натрия - 4,5. Индекс термоинактивации - 2,0 (при прогревании в течение 20 мин при 50°С). При фильтрации вируссодержащей суспен20 зии через миллипоровые фильтры размером 100 и 50 нм на снижение инфекционного титра не наблюдали Это свидетельствует о том, что штамм вируса имеет размеры до 50 нм и содержит в своем составе липопроте- 25 идную оболочку. На основании морфологических, морфогенетических и антигенных признаков выделенный штамм вируса отнесен к семейству Flavividae штамму вируса японского энцефалита.

30 Культуральные свойства.

Взаимодействие штамма вируса ЯЭ с культурами клеток различного происхождения (СПЭВ, ВНК, 4647) происходит в форме острой инфекции, сопровождает деструк35 цией клеток с накоплением вируса в культу- ральнуго среду в титрах 7,0-7,5 Ig ТЦДбо/мл. Аналогичные значения титров вирус достигает в этих культурах и при титровании методом бляшек (под агаровым покрытием).

40 Штамм вируса ЯЭ (ГКВ-677) характеризуется высокой репродуктивной активностью при титровании в культурах клеток куриного эмбриона, вызывает цитопатогенный эффект при заражении 24-часовог о монослоя

45 клеток и накапливается в среде этих культуру в титрах до 9,5 Ig БОЕ/мл или ТЦДзо/мл, при роллерном выращивании титры вируса колеблются от 10,0 до 10,5 Ig Е/мл при этом в среде зараженных культур накапливаются

50 гемагглютинины в титре до 1:256. Антигенные свойства. Антигенные свойства штамма изучены в перекрестных реакциях: РТГА, реакции биологической нейтрализации.В реакциях ис55 пользовали гипериммунные асцитические жидкости мышей к штаммам: Накаяма, Джагар 01, Пекин-1, ВК-4 и к гомологичному штамму - клону N 3 вируса ЯЭ. В РТГА использовали боратно-солевые антигены этих штаммов (8-16 АЕ), в РБН 100 БОЕ

на клетку вируса в виде мозговой суспензии зараженных мышей-сосунков По данным РТГА и РБН штамм вируса ЯЭ имеет близкое антигенное родство со штаммами Джа- гарОГ, Накаяма, ДВК-4, Пекин-Г.

В табл. 1 представлены антигенные связи штамма вируса ЯЭ.

В табл.2 представлены сравнительные данные антигенной активности штамма вируса ЯЭ (данные РТГА).

Из данных табл. 2 видно, что штамм вируса японского энцефалита характеризуется широким спектром антигенных связей с различными вариантами вируса ЯЭ.

Биологические признаки.

Штамм вируса японского энцефалита является слабо-патогенным вариантом для мышей линии и беспородных животных. У зараженных мышей вирус вызывает типичную картину менингоэнцефалита с инкубационным периодом 4-5 дней. Вирус патогенен при внутримозговом введении мышам; максимальные титры (в логарифмах ЛДбо) составляют 6,5-7,0. При периферическом введении мышам массой более 7 г штамм не вызывает заболеваемости и гибели животных. Индекс инвазивности штамма составляет 6,5-7,0. Вирусоспецифическая РНК штамма, выделенная из культуральной жидкости, собранной с зараженных культур клеток куриного эмбриона, обладает инфекционными свойствами как для культур клеток, так и для мышей при внутримозговом введении материала.

Иммуногенные свойства

Двукратная (подкожная и внутрибрю- шинная) инъекции с интервалом в один день культуральной жидкости, собранной через 24 ч после заражения штаммом вируса ЯЭ клеток куриного эмбриона и содержащей, как правило 109 Ig БОЕ/мл вируса ЯЭ, белым мышам сопровождается появлением у них специфических антигемагглютининов в титре до 1:320, достигающих таких значений х 15-му дню после последней иммунизации, и вируснейтрализующих антител, способных нейтрализовать 4,0-4,5 Ig гомологичного и изологичного (штамм ДВК-4 вируса ЯЭ) вируса

Диагностический препарат-антиген из штамма вируса ЯЭ - получают путем внут- римозгового заражения новорожденных белых мышей. Из мозга животных, взятых на высоте клинических проявлений заболевания, готовят антиген путем сахарозо-ацето- новой экстракции по методу D. clarke, J. Casals. Диагностическую иммунную асцити- ческую жидкость готовят по методу С. Я. Гай- дамович с соавторами

Профилактический препарат (культу- ральную инактивированную вакцину 1 готовят из культуральной жидкости, собранной из инфицированных штаммов вируса ЯЭ 5 культур клеток куриного эмбриона, выращенных роллерным способом и инактивиро- ванной формалином в концентрации 1.2000. Пример 1. Лабораторная диагностика инфекции, вызванной вирусом ЯЭ у мы10 шей в условиях эксперимента.

Материал для исследования - сыворотки крови мышей, инфицированных штаммом Джагар 01 вируса ЯЭ, взятые в начальном периоде нелетальной инфекции

5 и через 20-25 дней. Проводят постановку серологических реакций РТГА и РБН с использованием сахарозо-ацетонового антигена, приготовленного из штамма вируса ЯЭ и его культурального антигена. Реакции ста0 вятся по общепринятому методу.

Результаты исследований сывороток приведены в табл. 3 с использованием стандартных и предлагаемых диагностикумов. Таким образом, использование предла5 гаемого штамма для приготовления диагностических препаратов способствовало повышению диагностической эффективности лабораторных исследований у мышей, инфицированных вирусом японского энце0 фалита

П р и м е р 2. Получение вирусосодер- жащей культуральной жидкости, необходимой для производства культу ральных диагностических и профилактических пре5 паратов на основе производственного штамма Пекин-1 и предлагаемого клона № 3 вируса ЯЭ.

Материал для исследования - производственный штамм Пекин-1 и автор0 ский штамм - клон № 3 вируса ЯЭ, а также монослой клеток почки сибирского хомячка, используемый для производства культуральной инактивированной вакцины японского энцефалита, и 9-дневных куриных

5 эмбрионов Для заражения используют 10 БОЕ на клетку каждого из этих штаммов и после часового контакта неадсорбировавший вирус удаляют и вносят после трехкратного промывания монослоя ростовую среду

0 (среда 199) с 0,1 % гидролизата лактальбуми- на и 1 % сыворотки крупного рогатого скота (для культур клеток почек сирийского скота - для клеток куриного эмбриона) Сбор вирус- содержащей жидкости проводят в опти5 мальные для каждого вируса сроки (на 3-й день для штамма Пекин-1 и через 24 ч для штамма клона № 3) Полученные сравнительные результаты приведены в табл. 4

Таким образом, предлагаемый штамм для производства культуральных диагностических и профилактических препаратов позволяет использовать более экономичные и доступные культуры клеток куриного эмбриона, обеспечивает получение препаратов в короткие сроки с высокой антигенной активностью и содержанием вирусных частиц высокой концентрацией, что позволит почать эффективные диагностические и профилактические препарат.

Пример 3. Выявление вирусспеци- фичееких антител в сыворотках людей в Хабаровском крае.

Материал для исследования - сыворотки крови людей, полученные из Хабаровского НИИЭМ. Сыворотки изучают в РТГА с использованием коммерческого фильту- рального диагностикума к вирусу японского энцефалита и культура л ьного диагностикума, полученного на основе авторского штамма вируса японского энцефалита Ре0

5

акцию ставят в микромодификации по общепринятому методу

Результаты исследований приведены в табл.5

Из табл. 5 видно, что культуральный ди- агностикум для РТГА, полученный на основе авторского штамма вируса ЯЭ, в ряде случае позволяете большей эффективностью выявлять антитела к вирусам ЯЭ в сыворотках здоровых людей по сравнению с коммерческим культуральным диагностикумом, что свидетельствует о преимуществе данного диагностического препарата для изучения популяционного иммунитета в очагах фла- вивирусных инфекций.

Формула изобретения Штамм Virus Japonic encephailidls ГКВ 677, для приготовления диагностических и 20 профилактических препаратбв.

Использование: вирусология, Оригинальный штамм вируса японского энцефалита (ЯЭ), клон № 3, выделен из культур клеток головного мозга мышей-сосунков, хронически инфицированных клоном 33 вируса японского энцефалита, на 422 день со дня заражения клеток с последующим трехкратным клонированием из бляшки. Инкубационный период составляет 3-4 дня для новорожденных белых мышей. Инфекционный титр составляет 6,5 Ig LDso/мл. Взаимодействие штамма с культурами клеток девятидневных куриных эмбрионов происходит в форме острой инфекции, сопровождается деструкцией клеток; при роллерном выращивании вирус накапливается в куль- туральной жидкости этих культур до 10,5 Ig БОЕ/мл и продуцирует в среду гемагглюти- нины в титре до 1:256 (оптимум рН 5,4) Боратио-солевые и сахарозоацётоновые антигены, приготовленные из штамма, агглютинируют эритроциты гуся в титрах 1:1024-1:10240 соответственно в широкой зоне рН. Штамм высокочувствителен к эфиру, хлороформу и дезоксихолату натрия, снижающим титр вируса на 4,0 Ig БОЕ/мл Штамм обладает высокой антигенной активностью и широтой связей с антигенами штаммов Накаяма, Пекин-1, Джагар 01, ДВК-4 вируса ЯЭ, имеющимися в коллекции лаборатории. Культуральные и мозговые антигены штамма отличались высокой иммуногеннои и протективной активностью, Штамм используется для приготовления специфических диагностических препаратов (антигенов, иммунной асцити- ческойжидкости, моноклональных антител), а также для разработки культуральнойинак- тивированной вакцины против японского энцефалита, которые успешно могут быть использованы для диагностики и идентификации вновь выделенных штаммов вируса ЯЭ, для изучения иммунного статуса и для профилактики заболеваний в эндемичных по японскому энцефалиту районах. Штамм депонирован р Государственной коллекции вирусов под номером 677. 5 табл С/ С х| ел ю о. О)

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4

Основные параметры, характеризующие репродукцию штаммов вируса ЯЭ в культурах

клеток.

Антитела в сыворотках людей к вирусам японского энцефалита.

Таблица 5