Способ определения липополисахаридного антигена Советский патент 1992 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к иммуноанали- зу.

Наиболее близким к предлагаемому способу является гетерогенный липосо- мальный способ определения высокомолекулярного антигена - человеческого хорионического гонадотропина (ХПГ). Способ осуществляется следующим образом: получают липосомы, внутренний объем которых содержит флуоресцентный маркер; на поверхность липосом ковалентно пришивают антитела (AT) против ХГТ. На нит- роцеллюлозный диск диаметром 1 см. предварительно сенсибилизированный AT против ХГТ (10-40 мкг/см2), обработанный раствором бысьего сывороточного альбумина (БСА), помещают исследуемый или контрольный образец биологической жидкости, содержащей ХГТ, и выдерживают 1 ч при комнатной температуре. После промывки диска буфером добавляют липосомы (330 нмоль липида на диск), инкубируют 1

ч при комнатной температуре и, облучая диск ультрафиолетовым светом, визуально наблюдают флуоресценцию маркера. По интенсивности флуоресценции судят о результатах анализа. В качестве маркера используют сульфородамин Б. Чувствительность анализа г/мл ( М)ХГТ. Недостатком прототипа является большой расход сенсибилизирующих AT и липосом, сложность и длительность получения липосом, сенсибилизированных антителами, качественное определение ХГТ, невысокая чувствительность анализа.

Цель предлагаемого изобретения - повышение чувствительности анализа.

Поставленная цель достигается тем, что в предлагаемом способе получают липосомы, нагруженные маркером, сенсибилизируют твердую поверхность антителами, инкубируют раствор исследуемого соединения, в качестве флуоресцентного маркера используют кальцеин в концентрации

СО

с

vj

СО О 00

0,17 М, липополисахаридный антиген включают в мембрану липосом на стадии их пол- учения, после инкубации липосом их разрушают ратвором Тритона Х-100 с концентрацией не менее 2%, регистрируют ве- личину флуоресценции, вычисляют процент относительного ингибирования иммуносор- бции известным способом и определяют концентрацию липополисахарида по калибровочной зависимости. На чертеже пред- ставлена калибровочная зависимость относительного ингибирования иммуно- сорбции от логарифма концентрации антигена.

Способ осуществляется следующим образом.

Пример 1. Получение липосом,

Липидную смесь, содержащую яичный лецитин:холестерин:дицетилфосфат в мо- лярном соотношении 2:1,5:0,22, растворяют в смеси хлороформ:метанол 2:1 м помещают в круглодонную колбу на 50 мл. На роторном испарителе при давлении 9,8 кПа получают липидную пленку, которую рас- творяют в 1,5 мл диэтилового эфира и объединяют с 0,5 мл 0,17 М раствора кальцеина, в котором растворяют липополисахаридный антиген из расчета 300 мкг антигена на 1 мкмоль суммарного липида. Полученную двухфазную систему подвергают действию ультразвука частотой 22 кГц 3-4 раза по 40-60 с. Полученную эмульсию помещают в круглодонную колбу на 50 мл и упаривают на роторном испарителе при давлении 40- 50 кПа до образования липосом. На конечной стадии получения липосом, для более-полного удаления органического растворителя, давление доводят до 10 кПа. Невключившийся кальцеин удаляют гель-фильтрацией на колонке с сефадек- сом G-50, уравновешенной трис-солевым буфером (ТСБ), а затем центрифугированием при 100000 д. Полученные липосомы в ТСБ хранят в концентрированном состоя- нии при +4°С. Л ПС антиген получают модифицированным методом Вестфаля путем водно-фенольной экстракции ацетон-вы- сушенной бактериальной массы. Концентрацию включенного маркера кальцеина выбирают равной 0,17 М, поскольку более низкие концентрации дают низкий прирост сигнала флуоресценции после разрушения липосом детергентом, а более высокие приводят к интенсивному вытеканию кальцеи- на из липосом за счет осмоса.

Пример 2 Количественное определение липополисахаридного антигена.

В лунки полистирольного планшета для иммуноанализа, предварительно сенсибилизированные моноклинальными антителами (МКАТ) в ТСБ в концентрации 1 мкг/мл, вносят 200 мкл сыворотки крови на 1 ч при комнатной температуре, затем лунки промывают ТСБ и вносят 200 мкл суспензии липосом, полученных по методу, приведенному в примере 1, инкубируют 3-4 ч, промывают ТСБ и заливают 200 мкл раствором Тритона Х-100 в концентрации не менее 2%, необходимого для эффективного разрушения фосфолипидного бислоя липосом и высвобождения флуоресцентного маркера в объем раствора. Более низкие концентрации детергента недостаточны для эффективного разрушения фосфолипидного бислоя липосом. После 10 мин лизирования регистрируют величину флуоресценции при длине волн возбуждения и эмиссии 492 и 520 нм соответственно. Регистрацию флуоресценции можно проводить непосредственно в лунках планшета. Величину процента относительного ингибирования иммуносорбции липосом (А) определяют с учетом контролей по формуле

A(Fi-Fb)x100%(F0-Fb),

где FI - величина флуоресценции анализируемого образца, FO - величина флуоресценции образца, в котором отсутствует определяемый антиген; Рь - величина фоновой флуоресценции, обусловленной неспецифической сорбцией липосом. Для различных образцов, содержащих ЛПС-АГ, получены значения величины флуоресценции, представленные в табл.1. Концентрация вычислена по калибровочной зависимости (см. чертеж).

Сравнение чувствительностей предлагаемого метода и прототипа правомерно, поскольку: ЛПС и ХГТ являются полимерными, высокомолекулярными антигенами (молекулярный вес ХГТ составляет 100 кД, а молекулярный вес ЛПС по данным гель- фильтрации составляет 1000 кД), обладающими множественными участками связывания с антителами; и в том и другом случае используются в качестве вещества, сенсибилизирующего твердую подложку антитела, и избыток липосом, несущих флуоресцентный маркер, константы диссоциации комплексов АГ-АТ для высокомолекулярных антигенов достаточно близки (108-109 ), следовательно, эффективность процесса связывания и последующего маркирования липосомами анализируемого антигена в обоих способах близки. Однако при постановке анализа предлагаемым способом увеличивается соотношение максимального сигнала флуоресценции от иммуносорбированных липосом (Fo) к сигналу фоновой флуоресценции (Рь), обусловленному неспецифической сорбцией липосом на поверхности твердого носителя, что приводит к ув ё- личению чувствительности анализа. Это позволяет достоверно регистрировать незначительное уменьшение величины флуо- ресценции, вызванное присутствием в исследуемом растворе антигена. По сравнению с прототипом чувствительность анализа увеличивается за счет того, что снятие концентрационного самотушения флуо- ресценции кальцеина, который включают липосомы в большой концентрации, после лизиса липосом приводит к увеличению величины флуоресценции (Fi). Сравнение полученных данных показывает, что чувст- вительность предлагаемого способа при сравнении молярных концентраций анализируемого вещества в 10-40 раз выше, чем у прототипа.

Пример 3. Построение калибровоч- ной зависимости.

Для построения калибровочной зависимости готовят ряд разведений ЛПС-АГ в ТСБ. Анализ проводят по методике, приве- денной в примере 1. Диапазон используемых для построения калибровочной зависимости концентраций ЛПС-АГ50-1500 нм/мл. На основании результатов анализа строят калибровочную зависимость процен- та относительного ингибирования (А) имму- носорбции липосом от десятичного логарифма концентрации ЛПС-АГ в нг/мл раствора. Из полученных величин А в % (как в примере 2) с помощью калибровочной за- висимости находят концентрацию ЛПС антигена. Наиболее целесообразно с точки зрения точности анализа проводить определение концентрации ЛПС антигена на линейном участке калибровочной кривой (см. чертеж). В том случае, если исследуемая сыворотка крови содержит количество ЛПС иное, чем линейный диапазон калибровочной зависимости, рекомендуется разбавить ее ТСБ таким образом, чтобы определяемые величины концентрации укладывались на калибровочную зависимость.

П р и м е р 4. Уменьшение расхода ре аТе н тов в г1роцессе анализа. При использовании предлагаемого способа расходы сенсибилизирующих твердую подложку антител и липосомэльных иммунореагентов в сравнении с прототипом предета в лё ны в табл.2.

Как видно из таблицы, расход иммунореагентов для проведения анализа предлагаемым способом значительно ниже, что важно при применении дорогостоящих мо- ноклональных антител и липосом, сенсибилизированных труднодоступными ЛПС антигенами,

Повышение чувствительности определения липополисахаридных антигенов микроорганизмов важно для более ранней диагностики инфекционных заболеваний по содержанию указанных антигенов микроорганизмов в сыворотке крови и других биологических жидкостях человека и животных. Изобретение может быть использовано в практике здравоохранения и научных исследованиях в области иммунобиологии и медицины для количественного определения ЛПС антигенов в сыворотке крови человека и животных, контроля за динамикой инфекционного процесса.

Формула изобретения

Способ определения липополисахарид- ного антигена в сыворотке крови, включающий получение липосом, нагруженных маркером, сенсибилизацию твердой поверхности антителами, инкубацию липосом с сывороткой крови и регистрацию результатов анализа, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности анализа, в качестве флуоресцентного маркера используют кальцеин в концентрации 0,17 М, липополисахаридный антиген включают в мембрану липосом на стадии их получения, липосомы разрушают раствором Тритона Х-100 с концентрацией не менее 2%, регистрируют величину флуоресценции, вычисляют процент относительного ингибирования иммунной сорбции липосом антигеном.

Таблица 1

Способ определения липополисаха- ридного антигена. Использование: для количественного определения липополиса- харидного антигена в сыворотке крови. Сущность изобретения: для определения липополисахаридного антигена получают липосомы, нагруженные флуоресцентным маркером, в качестве которого используют кальцеин в концентрации 0,17 М, включают липополисахаридный антиген на стадии получения липосом, сенсибилизируют твердую поверхность антителами, после инкубации липосом производят их разрушение детергентом, регистрируют величину флуоресценции, вычисляют процент относительного ингибирования иммуносорбции и определяют концентрацию липополисаха- рида по калибровочной кривой. Способ позволяет повысить чувствительность анализа. 1 ил.

Результаты определения концентрации липополисахаридного антигена

Сравнение расходов иммунореагентов

(о

2,о

Таблица 2

з,оw

fy 1№С нг/м