Способ определения антигена в биологической жидкости Советский патент 1992 года по МПК G01N33/535 

Изобретение относится к медицине и касается способа определения антигена методом иммуноферментного анализа (ИФА) и может быть использовано в диагностике заболеваний.

Цель изобретения - повышение точности за счет повышения чувствительности анализа.

Пример 1. Определение igG человека.

Кроличью сыворотку к IgG человека пропускают через иммуносорбент, полученный из IgG и BrCN-сефарозы, после отмывки колонки специфические антитела снимают 0,1 М глицин-HCI буфером с рН 5,0, затем эту же колонку промывают этим же буфером с рН 4,0, рН 3,0 и наконец рН 2,3. Полученные при различных рН антитела диализуют против 0,1 М карбонат-бикарбонатного буфера рН 9,6, уравновешивают концентрации белка и наносят в ячейки полистирольных планшетов, после процесса адсорбции и отмывки сорбированные антитела проявляют

конъюгатом антииммуноглобулина кролика, соединенной с пероксидазой, который рас- титровывают. Разведение конъюгата, дающее с антителами при длине волны 450 нм поглощение, равное 0,3, принимают как конечное разведение конъюгата.

Проводят определение константы равновесия, что дает представление о силе связывания антигена с антителами, снятыми с иммуносорбента при различных рН буферной системы по формуле:

XI

О СО

чэ

00 О

АО

1

1

АО -А

Кс

Вс

где АО - начальная концентрация антител;

А - концентрация антител при достижении системой равновесия;

В0 - начальная концентрация антигена.

Уравнение получено при выполнении следующего условия - начальная концентрация антигена В0 должна быть значительно выше начальной концентрации антител

АО.

Как видно из таблицы 1, антитела, снятые буферной системой при разных рН, обладают силой связывания с антигеном и разной адсорбционной способностью, наибольшей адсорбционной способностью и авидностью обладают антитела, снятые с иммуносорбента при элюции буферной системой при рН 2,3-2,7.

В табл.2 приводятся результаты изучения чувствительности метода ИФА определение IgG человека при использовании специфических антител, снятых с иммуносорбента в виде смеси с помощью одной буферной системы 0,1 М глицин-HCI рН 2,3 и с помощью нескольких буферных систем с различными рН. Представленные результаты свидетельствуют о повышении чувствительности метода в 4 раза по сравнению с прототипом при использовании антител с ,7х 1010.

Пример 2. Определение сальмонел- лезного Н антигена.

Кроличью сыворотку к Hd-антигену про- пускают через Hd-иммуносорбент на основе BrCN-сефарозы, все операции проводят аналогично примеру 1. Полученные результаты, представленные в табл.3, свидетельствуют о повышении чувствительности метода более 6 раз.

Пример 3. Определение сальмонел- лезного Н-а антигена.

Кроличью сыворотку к К-а антигену пропускают через иммуносорбент, состоящий из Н-а антигена и BrCN-сефарозы. Дальнейшие операции проводят аналогично примеру 1.

Полученные результаты представлены в таблице 4.

Таким образом, результаты исследования показывают, что независимо от использования антигена применение аффинных антител с константой равновесия не ниже 0,8±0,02х10 позволяет определять антиген в количестве 1 нг.

Формула изобретения Способ определения антигена в биологической жидкости путем проведения имму- ноферментного анализа на полистирольном планшете сорбированном аффинно выделенными антителами, отличающийся тем, что, с целью повышения точности за счет повышения чувствительности способа, используют антитела, аффинно выделенные с иммуносорбента при рН 2,3-2,7 и имеюю

щие константу равновесия 0,7x10 М

-1

Использование: изобретение относится к медицине и может быть использовано в диагностике заболеваний. Цель - повышение точности способа за счет повышения чувствительности анализа. Сущность: антиген определяют иммуноферментным анализом с применением полистирольных планшетов с сорбированными на них аф- финно выделенными антителами. Новизна заключается в том, что используют антитела, аффикно выделенные с иммуносорбента при рН 3-2.7 и имеющие константу равновесия 0,7х1010 . Это позволяет повысить чувствительность анализа в 4-6 раз.

Изучение аффинно выделенных антител к IgG человека

Таблица 2

Сравнительные данные чувствительности метода ИФА (определение IgG человека при использовании антител с различной константой равновесия)

Таблица 1

Таблица 3

Изучение чувствительности метода ИФА - определение сальмонеллезного Hd-антигена при использовании антител с различной авидностью

Таблица 4 Изучение чувствительности метода ИФА - определение сальмонеллезного Н-а антигена