СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОКЛЮШНОГО АНТИГЕННОГО КОМПЛЕКСА Советский патент 1995 года по МПК G01N33/531 

Изобретение относится к области медицины, а точнее к микробиологии и вакцинопрофилактике и может быть использовано при конструировании ареактогенных коклюшных препаратов.

Целью изобретения является снижение токсических свойств ультразвукового коклюшного антигенного комплекса.

Способ осуществляется следующим образом.

Используют ультразвуковой коклюшный антигенный комплекс, полученный путем ультразвуковой дезинтеграции коклюшных бактерий. Коклюшные бактерии выращивают на среде КУА при 35^оС в течение 48 ч. Микробную массу разводят 0,15 М и изотоническим раствором хлорида натрия до концентрации 1500 ОЕ/мл, добавляют мертиолат до концентрации 1:10000 для консервации и дезинтегрируют в ультразвуковом дезинтеграторе низкочастотным ультразвуком частотой 44 кГц, амплитудой 70 мкм в течение 15 мин. Затем полученную смесь центрифугируют при 18000 об/мин в течение 1 часа. Полученная надосадочная жидкость представляет собой ультразвуковой коклюшный антигенный комплекс. Затем ex temporae готовят детоксицирующий раствор, он содержит: 0,066 М раствор формальдегида (ФА) в забуференном 0,85%-ном растворе хлорида натрия (рН 7,2). Далее ультразвуковой коклюшный антигенный комплекс (УКА), содержащий 2400 мкг белка в 1 мл, соединяют с детоксицирующим раствором в равных объемах и шуттелируют при комнатной температуре в течение 20-25 мин и выдерживают в термостате при температуре +45^оС в течение 48 ч. Полученный в результате вышеуказанных приемов детоксицированный УКА (Д-УКА) менее токсичен, в нем сохранены иммуногенные свойства и он может быть использован для конструирования коклюшных вакцин.

Проверка токсических и иммуногенных свойств полученного Д-УКА, проведенная в соответствии с Инструкцией по отбору, проверке и хранению производственных штаммов коклюшных бактерий, показала, что его токсические свойства соответствуют стандартному образцу коклюшной вакцины, летальные свойства снижены на 100% а иммуногенность Д-УКА сохранялась на 100% по сравнению с исходным.

Выбор концентрации формальдегида, используемого для детоксикации, основывался на данных, полученных в результате изучения его влияния на токсические свойства УКА, которые оценивали по разности массы тела мышей на определенные сутки (i) по сравнению с исходными (0) (РМТi-o). Показатели разности массы тела мышей на 1 и 0 сутки, а также на 2 и 0 сутки свидетельствовали о детоксикации термолабильного и термостабильного токсинов, а разность массы тела мышей на 4 и 2 сутки указывают на детоксикацию коклюшного токсина, входящего в состав УКА. Показатели РМТ_7-0 свидетельствовали об общей токсичности излучаемых коклюшных антигенных комплексов.

Основываясь на приведенных данных, можно сделать вывод, что использование 0,033 М ФА является целесообразным, т.к. ведет к детоксификации токсических субстанций, входящих в состав УКА и снижает общую токсичность УКА аналогично стандарту коклюшной вакцины (000-3), РМТ_7-0 при использовании УКА, детоксицированного 0,033 М ФА, соответствует 2,57, в то время как РМТ_7-0 при введении 000-3= 2,5. Применение более высоких концентраций ФА для детоксикации УКА не является оправданным, так как ФА является токсическим веществом, и предложенная его концентрация 0,033 М является максимальной, которая позволяет снизить токсичность изучаемых препаратов до уровня стандарта (ОСО-3).

Для детоксикации УКА был избран температурный режим воздействия +45^оС, который отработали в опытах на лабораторных животных.

П р и м е р 1. Для детоксикации использовали УКА, полученный методом ультразвуковой дезинтеграции коклюшных бактерий шт. 345, выросших на казеиново-угольном егере (УКА) при температуре +35^оС в течение 48 часов. Микроорганизмы собирали с питательной среды, суспендировали в 0,85% растворе хлорида натрия (рН 7,2), доводили густоту микробной взвеси до 1500 ОЕ/мл и дезинтегрировали ультразвуковой частотой 44 кГц и амплитудой 70 мкм в течение 15 мин. Затем дезинтеграт центрифугировали при 18000 об/мин в течение 1 часа при +4^оС. 100 мл надосадочной жидкости, представляющей собой УКА, содержащий 2400 мкг/мл белка, соединяли со 100 мл детоксицирующего раствора 0,066 М ФА. Полученный таким образом продукт содержал 1200 мкг белка и 0,033 М ФА. Далее полученный продукт встряхивали на шуттельаппарате 20-25 мин, выдерживали при +45^оС в течение 48 ч.

Токсические и иммуногенные свойства полученного детоксицированного УКА изучали в соответствии с Инструкцией по отбору, проверке и хранению производственных штаммов, коклюшных бактерий М. 1987.

Иммуногенные свойства УКА определяли на мышах СВ А массой 10-12 г. Животных иммунизировали однократно в дозах 5-1-0,2 мкг по белку. Через две недели состояние иммунитета определяли внутримозговым введением 219 ЛД₅₀ коклюшных бактерий шт. 18,323 ЕД₅₀ вычисляли по методу Вильсон и Вустера.

Полученный предлагаемым способом УКА, обладает выраженными защитными свойствами и предохраняет животных от развития экспериментального аллергического энцефаломиелита: ЕД₅₀ полученного детоксицированного УКА составила 0,62 мкм по белку, а ЕД₅₀ исходного УКА 0,77 мкг. Таким образом, снижения иммуногенных свойств коклюшного антигенного комплекса при использовании данного режима детоксикации не наблюдается, а напротив, имеется тенденция к их повышению.

Токсичность детоксицированного УКА оценивали путем определения летальной дозы при внутрибрюшинном введении мышам 500-250-125 мкг по белку и по характеру изменения массы тела мышей в течение 7 суток после введения УКА.

Результаты опытов по определению токсичности показали, что летальное действие УКА, детоксицированного ФА, снижается на 100% в дозах 250 и 125 мкг по белку, тогда как недетоксицированный УКА в дозах 250 и 125 мкг при введении экспериментальным животным индуцировал высокую летальность: 80% и 60% соответственно. Через 7 дней наблюдения средний прирост массы тела на мышь в дозе 125 мкг составил 2,57 мкг, что соответствует введению стандартного препарата коклюшной вакцины (ОСО-3) в адэкватной дозе, а также требованиям, предъявляемым к коклюшным вакцинам, используемым в серийном производстве.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить нетоксичный ультразвуковой коклюшный антигенный комплекс, обладающий высокой иммуногенностью.

Изобретение относится к области медицины, точнее к микробиологии и вакцинопрофилактике, и может быть использовано при конструировании аректогенных бесклеточных коклюшных вакцин. Цель - снижение токсических свойств антигенного комплекса. Способ пол коклюшного антигенного комплекса предусматривает культирование коклюшных микробов на среде КУА, приготовление взвеси коклюшных бактерий, ее дезинтеграцию низкочастотным ультразвуком, центрифугирование, далее к ультразвуковому коклюшному антигенному комплексу добавляют детоксирующий раствор, содержащий формальдегид 0,033 М, шуттелируют при комнатной температуре в течение 20-25 мин и инкубируют при 45°С в течение двух суток. Данный способ позволяет снизить токсические свойства исходного антигенного комплекса при сохранении высокой иммуногенности.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОКЛЮШНОГО АНТИГЕННОГО КОМПЛЕКСА, включающий культивирование коклюшных микробных клеток, приготовление взвеси клеток с последующей дезинтеграцией клеток низкочастотным ультразвуком, центрифугированием и выделением надосадочной жидкости, содержащий антигенный комплекс, отличающийся тем, что, с целью снижения токсических свойств антигенного комплекса, к надосадочной жидкости добавляют формальдегид в концентрации 0,033 М, щуттелируют в течение 20 25 мин при комнатной температуре и инкубируют при 45^oС в течение 48 ч.