СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕКТИВНОГО КОКЛЮШНОГО АНТИГЕНА Российский патент 2000 года по МПК A61K39/10 A61K39/385 

Изобретение относится к области здравоохранения, а точнее к микробиологии и вакцинопрофилактике, и может быть использовано при конструировании ареактогенного коклюшного вакцинного препарата.

АКДС-вакцина относится к наиболее распространенным в практике вакцинопрофилактики препаратом. Однако ее применение значительно осложнено высокой реактогенностью, обусловленной, как считает большинство исследователей, корпускулярным коклюшным компонентом Riolgway D. e.a. "Обсуждение требований к повреждающим свойствам коклюшных вакцин в рамках Национальной Программы по компенсации повреждающего действия вакцин". Y. Investing. Med. 46:168, 1999, Apr). Возможность индукции и поствакцинальных осложнений коклюшной вакциной ведет к сокращению объемов профилактических прививок и расширению противопоказаний и вакцинации, что, в свою очередь, формирует существенное уменьшение иммунной прослойки населения и влечет за собой вспышки этой инфекции, носящей массовый характер, о чем свидетельствуют работы Mertens P.Z. e.a. "Эпидемия коклюша среди взрослых людей в Нидерландах". Eur. Y. Clin. Microbiol. Inject. Dis. 1999 г., 28:16 (44):242-7; Blakely T.A. e.a. "Эпидемия коклюша в Новой Зеландии": эффективность вакцинации", N.Z. Med, Y. 1999 г., Apr 9:113 (1085):118-20, и др. В последние годы отмечено формирование заболеваний коклюшем не только у непривитых, но и у полноценно привитых детей (Williams Y.V. "Смертельные случаи коклюша у привитых детей в Южном Уэльсе в 1996-1997 гг" Med. Y. 22:139, 1998, Apr 16). Этот факт может быть обусловлен как слабой иммуногенностью применяемых вакцин, так и широко распространенными в настоящее время врожденными или приобретенными иммунодефицитами у детей.

Поэтому, несмотря на значительные успехи в области разработки и применения бесклеточных коклюшных вакцин, эта проблема по прежнему остается актуальной. Публикации последних лет свидетельствуют о том, что разработкой бесклеточных коклюшных вакцин продолжают заниматься во многих странах мира. (Conrad D. A. Denson H.B. "Применение бесклеточных коклюшных вакцин для иммунизации детей.: Потенциальная польза превышает потенциальный риск"., Postgrad. Med. 1999, Jun 105 (7):165-8,171-3,177-8).

Проведенными исследованиями по научно-медицинской и патентной литературе выявлены различные способы получения протективных коклюшных антигенов. Так, в работе Н. С. Захаровой с соав. "Бесклеточная коклюшная вакцина на основе природного комплекса антигенов, выделенных из супернатанта синтетической среды культивирования". Журн. Микробиол., 1997, N 3, с, 67-70) описан способ получения протективного коклюшного антигена из супернатанта культуры B. pertussis, выращенной на специально разработанной питательной среде с различными добавками, стимулирующими накопление антигенных субстанций, ответственных за формирование специфического иммунитета в организме (коклюшный токсин, филаментозный гемагглютинин, и др.) с последующей детоксикацией для перевода активных форм токсинов в токсоиды. В журнале Curr. Microbiol (Curr Microbiol 1999, May 38(5)% 273-8) Horbor D. e.a. изложен способ получения протективного коклюшного антигена из везикул наружной мембраны бактериальной клетки B. pertussis методом многоступенчатой хроматографии. Dias W.O. e.a. ("Бесклеточная коклюшная вакцина" Third. Animals Vaccines new techologies. - 1995 - P. 20-22) предлагают для этой цели использовать высокоскоростные вакуумно-рефрижираторные ультрацентрифуги для получения протективного антигена из супернатанта бактериальной массы B. pertussis с последующей его детоксикацией.

Однако процесс приготовления указанных протективных коклюшных антигенов сложен, многоэтапен, трудоемок и требует больших материальных затрат. Известны случаи реверссии коклюшных токсинов из токсоидов в активные формы, что ограничивает применение таких антигенов в качестве компонентов коклюшной бесклеточной вакцины.

Известен "Способ получения протективного коклюшного антигена" - патент N 1309364 СССР, Мкл A 61 K 39/10. Способ заключается в том, что разрушенную низкочатортным ультразвуком бактериальную массу коклюшных микробов диализуют через целлофановую мембрану с размерами пор 40-60 , при этом разрушенные бактерии и их диализат дополнительно ежедневно однократно в течение 3-5 минут озвучивают низкочастотным ультразвуком в течение 3-4 суток.

Недостатком этого способа является недостаточная иммуногенная активность полученного препарата.

Целью настоящего изобретения является повышение иммуногенных свойств протективного коклюшного антигена.

Эта цель достигается тем, что к 0,1 мкг по белку протективного антигена добавляют 0,1 мкг синтетического полиэлектролита - полиоксидония, растворенного в фосфатном буфере (pH - 7,2), перемешивают в магнитной мешалке при температуре 37^oC в течение 20 минут, затем при температуре 3-6^oC - 3 часа, с последующим фильтрованием через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Полученный конъюгированный и протективный коклюшный антиген на основе синтетического носителя - полиоксидония, характеризуется высокими иммуногенными свойствами (% выживаемости - 95%).

Использование синтетического полимера - полиоксидония обусловлено его способностью за счет своей полимерности к многоточечному взаимодействию с комплементарными макромолекулами антигена, а также с комплементарными макромолекулами иммунокомпетентных клеток, что ведет не только к формированию специфического иммунного ответа, но и к усилению общего иммунопоэза организма (Р. В. Петров, Р.М. Хаитов. "Вакцины нового поколения на основе синтетических полионов: история создания, феноменология, механизмы действия и внедрение в практику". Жур. "Иммунология", 1998, N 5, с. 4-11; Р.М. Хаитов. "Вакцины нового поколения на основе структурного объединения антигенов и синтетических полимерных иммуномодуляторов". В сб. "Патогенетические основы лечения острых инфекционных заболеваний". М., 1999, с. 53-73). Обладая низкой токсичностью и высокими каталитическими свойствами, полионы легко выводятся из организма, не причиняя ему вреда.

Подробное описание способа и пример его осуществления:
3-х суточную культуру B. pertussis, выращенную на среде КУА (казеино-угольный агар) суспендируют в стерильном 0,15 М растворе хлорида натрия, разрушают воздействием низкочастотного ультразвука в течение 5 минут, помещают в целлофановый мешок с размерами пор 40-60 для диализа. Диализ проводят против 0,15 М раствора хлорида натрия, предварительно озвученного низкочастотным ультразвуком в течение 5 минут, на холоду (t = 3-6^oC) в шуттель-аппарате в течение 4-х суток. Раствор, в котором находится разрушенная бактериальная масса ежедневно, однократно обрабатывается 5 минут ультразвуком. Выделенное таким образом вещество является коклюшным протективным антигеном.

Затем 0,1 мкг по белку протективного коклюшного антигена соединяют с 0,1 мкг полиоксидония, растворенного в 0,05 М растворе фосфатного буфера (pH - 7,6-7,8). Смесь перемешивают в магнитной мешалке в течение 20 минут в условиях термостата при температуре 37^oC, выдерживают в рефрижераторе 3 часа при температуре 3-6^oC, фильтруют через фильтр с размерами пор 0,45 мкм и получают конечный продукт - протективный коклюшный антиген на основе синтетического носителя с высокими иммуногенными свойствами (% выживаемости - 95%).

Образование комплекса - антиген-синтетический носитель, происходит путем ковалентной конъюгации, при которой используются традиционные методы ковалентного связывания: карбопептидный и реакция альдегидных групп с пептидными аминогруппами. Не вступившие в реакцию с антигеном альдегидные группы блокируются триоксиаминометаном.

Контроль качества полученного протективного антигена осуществляют в тесте проверки иммуногенных свойств коклюшных препаратов, описанном в Инструкции по отбору, проверке и хранению штаммов B. pertussis для изготовления коклюшной вакцины и коклюшного компонента ассоциированных вакцин". М., 1987 г.

Как видно из таблицы, использование протективного коклюшного антигена в дозах 0,05 - 0,1 - 0,2 мкг по белку не обеспечивало достаточно высокой защиты мышей, взятых в опыт, от развития экспериментального аллергического энцефалита (ЭАЭ) и процент выживаемости животных не превышал 15% (группы 1, 2, 3). Введение в организм экспериментальных животных различных доз полиоксидония вообще не формировало специфической защиты - процент выживаемости равен 0 (группы 4, 5, 6).

Использование протективного коклюшного антигена в дозе 0,05 мкг по белку при различных дозах конъюгата (полиоксидония) было недостаточным для формирования глубоких иммунологических сдвигов, препятствующих развитию ЭАЭ. Процент выживших животных составлял от 10 до 25% (группы 7, 8, 9). Увеличение дозы протективного коклюшного антигена до 0,1 мкг по белку в комбинации с различными дозами полиоксидония приводило к резкому увеличению защитного эффекта, % выживаемости экспериментальных животных повышался до 90 - 95% (группы 11, 12). Последующее увеличение доз как протективного антигена, так и полиоксидония, существенно не влияло на иммуногенные свойства конъюгированного препарата. Поэтому оптимальными параметрами для протективного коклюшного антигена и полиоксидония была выбрана доза, равная 0,1 мкг.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет повысить иммуногенные свойства протективного коклюшного антигена в 8 - 10 раз.

Изобретение относится к медицине, а точнее к микробиологии и вакцинопрофилактике, и может быть использовано при конструировании ареактогенного коклюшного вакционного препарата. Сущность изобретения заключается в том, что к 0,1 мкг по белку протективного антигена добавляют 0,1 мкг синтетического полиэлектролита - полиоксидония, растворенного в фосфатном буфере, перемешивают в магнитной мешалке при температуре 37^oC - 20 мин, затем при температуре 3 - 6^oC - 3 ч, с последующим фильтрованием через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Изобретение позволяет получить коньюгированный протективный коклюшный антиген на основе синтетического носителя - полиоксидония, характеризующийся высокими иммуногенными свойствами (% выживаемости 95%). 1 табл.

Способ получения протективного коклюшного антигена, предусматривающий выращивание микробной массы, отличающийся тем, что к 0,1 мкг протективного коклюшного антигена добавляют 0,1 мкг синтетического полиэлектролита - полиоксидония, растворенного в фосфатном буфере, перемешивают в магнитной мешалке при температуре 37^oC 20 мин, затем при температуре 3 - 6^oC - 3 ч, фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и получают конечный продукт - протективный коклюшный антиген с высокими иммуногенными свойствами.