Способ получения солей N-ацил-или N-арилдезоксинуклеозид-5 @ -фосфатов Советский патент 1992 года по МПК C07H19/10 C07D239/47 C07D473/18 C07D473/34 A61K31/70 

Изобретение относится к химии Сахаров, а именно к усовершенствованному способу получения солей N-ацил- или М-арил-дезоксинуклеозид-5 -фосфатов общей формулы 1 о

НО-Р-ОСНа г, ВчЪ Х

он где 1а: В - остаток аденина - мнсос6н5

№

i N

16: В - остаток цитозина - , мнсос6н5

(1

-Л-Л

1в: В - остаток гуанина - . ,о

W

NH

NHCCH(CHj)j ,

которые могут быть использованы га качестве промежуточных продуктов в синтезе де- зоксиолигонуклеотидов, являющихся биологически активными веществами, а также для получения ДНК-зондов для медицинской диагностики.

Известен способ получения М-ацил-мли N-арилдезоксмнуклеозид-б -фосфатов путем взаимодействия избытка ацил- или арилхлорангидрида с дезоксинуклрозид-51 фосфатом в пиридине с последующим щелочным гидролизом образованньч ацил- или арилфосфатных и 31-0-ацил- или арилэ- фирной связей. Для этого реакционную смесь после ацилирования при комнатной температуре обрабатывают 1 М раствором NaOH при 0°С в течение 5-10 мин с последующей нейтрализацией избытка щелочи

Х|

О 00

ионообменном смолой, /.рлео ./чомную натриевую соль нуклеотпдного материал; переводят в пиридипиоиую соль с помощью хроматографии и пь. долпюч мс-:- о и проДУК 1 С ПОМОЩЬЮ лООГ. ПЮ1 РОфоч на НОЛТО

лозе илиофипизацин.

Однако известный опое.-;л .-jOnin : nq

ДОМ СуЩОСТВеНИЫХ НОДОСта

- НеДОСТЗ 1 ОЧ1Ю ВЫСОКИЙ ; :- г по; --. Продукта (ДЛЯ UoA-70% Г|;Л. - Ч- :: . ; - 70%);

- НеОбХОДИМОСТЬ Г рОПСЫеНП - : - К; .НН

деблокирования в жесткие у г г ; :-... : I1.. NaOH, 0°С, 5--10 мин), н---, :-оо вода получаемой натриевом соли нуллоон - да з пиридиниевую соль.

Целые настоящего изоос-зген;1;,1;- ;;- Р .о- ся повышение выходи целевого нрелукго ii упрощение процесса.

Поставленная цель доети; ; етс;; предлагаемым способом получения N-зцн/ или N- арилдезоксинуклеозид-5 -фосФато. включающим взаимодействие ацил- или а ри л хл о ран гидрида соответствующей к ;.;;:- лоты с соответствующим дезоксимухлеоти- дом в пиридине при мольном соотношении (2-3): 1 с последую и (им выдерживанием пел к- ционной смеси при комнатной температуее, охлаждением .этой емвси. гидролизом продукта реакции и ныдолением целевого продукта хромэтогозфией, при этом дезоксинуклоотнд предварительно обрабатывают 4 5 Kp;:iTi;HM изиь;тком грпметилх- лорсиланз и срп.аог г ц-.г чдина. пкрпд, стадией гидролиза смесь охлаждаю ; ;;о О -(-30)1 С, гид ролиз осуществлял)т 1,5-2,5 М зодпыг-i раствором амми а к а ь п р и с у т с т п и и триэтиламина, взятого п количестве зкои- мольном по отношению к суГ -|мар юму количеству исходных реагентов, включая триметилхлорсилан, а цеповой продукт выделяют обрзщенно-фазопой хроматографией в виде солей тризтиламмония, причем в случае получения аденозннсодсржащего продукта реакционную смесь выдерживают в течение 90-120 мин, при получении цитидипспдер- жащего продукта - 5-15 .мин, а в случае гуанозимсодержащего 30-60 мин.

Пример 1. Синтез М 1-о 8нзоилдезок сиаденозин-5 -фосфата, трпгзтнламмоний- нойсоли,

В круглодонную колбу рместимоодью 50 мл загружают 1 г(3,02 ммоль)дезок.сиаде о- зин-5 -фосфата в ЬЬ-форме и cyiuar в эксикаторе над PaOs при 4 мм рт, ст, в течение 40 мин. К высушенному нуклеотидному материалу добавляют 14,6 мл пиридина и 1,53 мл (12,08 ммоль) трь-доетилхлорсилана, закрывают колбу и встряхивают ее в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем

ч .нпон реакционной глзссе с образо- ;::,;.,:к, осадком iиридин.и хлорида ,цо- НгН ;:но 1);70 мл (6,04 мглоль) бензоил х/|ори.аа и выдержи на юг при встряхивании i иачопно 2 ч мои комнатной температуре.

п

до (, добавляют 13,22 мл Н.0, ;.; Л -лп (2 i ,14 ммоль)триэтиламииа и 5,66 мл .. (24%) и пыл.ержпгз.ают 15 мин при комнатной температуре. Полученную вод- по-пири.диние(.ую смесь упаривают на рота- iiHOHiiOM испарителе до маслообразного остатка, затем этот остаток упаривают с толуолом (2x20 мл). К полученному остатку до- Л зл;;юг 2U мл Н/0 - наносят на колонку с сорбентом Силаоорб С8 (I..C) (объем колон- н - 200 мл). Провопят спюцию сначала во- ,;1пи (0.2 л), затем градиентом ацетонитрмла л поде: 0 15% (1 л). Фрчкци;о, содержа- :;;vio целевой продукт, упоригают и высажи- г. серный фир. Выпавший осадок отопльтропывают л cyuiaT в вакуум-эксикаторе, РыходТЭА с.1ри7.Л- 1.30 г (30,2%). Эле- монтн -,й анализ: С 52,1 (51,49); Н 6,18(6,20); N К;, i / (1 6,21 r n .ах приведены тесре- Tir-ieci-.iio . на- Снпп). Спектральный анализ: .,,.- -цоо in ; М -см . } , соотношения п буфере Трис aiiei;IT. nH 8.0:

250/2 Г;00,91 - 0,03

270/2601,33

200/2601,71

200/260f1,36

П п п г. е о 2. Синтез N -Оензоилдезок- сицитидин-5 -i;;осфата, триэтнл;. ммоннй- ной со;;HI.

Син:ез ведут аналогично описанному в примере 1, за исключением того, что в реакцию б...-рут 0,93 (3,02 ммоль) дезо:-сицити- дин-5 -Фосфатэ а biz-Форме и реакцию иепзсилироезним ведут 5 мин. Выход T3A : clpbzC - 1,30 г (84.0%). Элементный анализ: С 52.1 (51,56); Н 6.45(6.49); N 11,15 (10,93). Спектральный анализ:

Спектральные соотношения в буфере .рис-ацетэт, phi 8.0:

250/2600,85 ± 0,03

270/2600,72

280/2600,44

290/2600,46

П р и м е Р 3. Синтез.Н2-изобутирилде- :.Ю оигуанозмн-5 -фосфата, тризтиламмо- нийнойсоли.

Синтез ведут аналогично описанному в .примере 1, зв исключением того, что в реакцию берут 1,08 г (2/12 ммоль) дезоксигуано- зин-5 -фосфата, ТЗ -соли и 0,76 мл (7,26 ммоль) изобутирил хлорида, а реакцию изобутирилирования ведут 30 мин. Выход T3A+dpibuG - 0.98 г (78%). Элементный анализ: С 47,0 (46,33); Н 6,75 (6.80); N 16,23 (16,21). Спектральный анализ:

.75104

Спектральные соотношения в буфере Трис-ацетат, рН 8,0:

250/2600,85 +0,03

270/260 0,76

280/260 0,72

290/260 0,60

Примеры 4-11, Выбор времени реакции бензоилирования для dpA.

Синтез ведут аналогично описанному в примере 1, при этом время выдерживания реакционной смеси после добавления бен- зоил хлорида меняют от 5 мин до 3 ч. Резуль- таты приведены в табл. 1.

Примеры 12-15. Выбор времени реакции бензоилирования dpC.

Синтез ведут аналогично описанному в примере 2, при этом время реакции бензо- илирования меняют от 2 мин до 60 мин. Результаты приведены в табл. 2.

Примеры 16-20. Выбор времени реакции изобутилирования dpG.

Синтез ведут аналогично описанному в примере 3, при этом время реакции изобутилирования меняют от 2 мин до 60 мин. Результаты приведены в табл. 3.

Примеры 21-27. Определение оптимальной температуры реакционной смеси при добавлении водного аммиака.

Синтез ведут аналогично описанному в примере 1, при этом меняют температуру реакционной смеси перед гидролизом водным раствором аммиака от 37 до -30°С. Ре- зультаты приведены в табл. 4.

Примеры 28-34. Выбор оптимальной концентрации водного аммиака в реакционной смеси.

Синтез ведут аналогично описанному в примере 1, при этом меняют концентрацию аммиака в реакционной смеси от 0,5 до 4,0 М. Результаты приведены в табл. 5.

Примеры 35-39. Определение оптимального соотношения ацилхлорида к де- зоксинуклеотиду.

Синтез ведут аналогично описанному в примере 1, при этом меняют соотношения бензоилхлорида к дезоксинуклеотиду. Результаты приведены в табл. 6.

Примеры 40-43. Определение оптимального соотношения триметилхлорсила- на к дезоксинуклеотиду.

Синтез ведут аналогично описанному в примере 1, при этом меняют соотношения триметилхлорсилана к дезоксинуклеотиду, Результаты приведены в табл. 7.

Примеры 44-45. Обоснование необходимости использования в процессе триэ- тиламина.

Синтез ведут аналогично описанному в примере 1, при этом перед гидролизом реакционной смеси водным аммиаком водном случае добавляют триэтиламин (пример 44), в другом случае (пример 45) - не добавляют. Результаты приведены в табл. 8.

Примеры 46-47. Выбор метода выделения целевого продукта.

Синтез ведут аналогично описанному в примере 1, при этом выделяют целевой продукт обращенно-фазовой хроматографией (пример 46) или хроматографией на целлюлозе (пример 47). Результаты приведены в табл. 9.

Таким образом, предложенный способ получения солей N-ацил- или N-арилдезокси- нуклеозид-5 -фосфатов позволяет повысить выход целевого продукта с 49-70% до 78- 84% и упростить процесс за счет применения для выделения продукта высокоскоростной обращенно-фазовой хроматографии, исключения трудоемкой стадии хроматографиче- ского перевода натриевой соли нуклеотидного материала в пиридуниевую (процесс длительный, требует упаривания больших объемов водных растворов элюата, что можно отнести и к хроматографии на целлюлозе), а также за счет того, что стадия гидролиза не требует строгого технологического контроля за временем и температурой процесса, Кроме того, предлагаемый способ позволяет снизить количество примесей в целевом продукте до 3-5%.

Формула изобретения

1. Способ получения солей N-ацил- или N-арилдезоксинуклеозид-б -фосфатов общей формулы

о но-p-ocHj /0

6 Ip (

он где В - остаток аденина - мнсос н

&#

N N

или В - остаток цитозина NHcoc6Hj

Лы ,

СЛо

или В - остаток гуанина

N N NHCCH(CH3)2 ,

о

л, ч i i i л ч с ь i.j iримстилулорсилан а це

р) , i и i i и с Г)и гшленяю обращенно-фазо1гоР Г| ч и1 1 1 f и v, тч юм хромаiаграфией о виде солей

пири/ч н 1 п п т i ч миркам Г-р 1 гиламмонил

j 1 р н i n vi m i, or г мс г ч приС С п особ по п 1 отличающийся

чпмтп си iep i mivpn с 1Г юдующпг it о при потучении аденозинсодержаin pr ГР i i гц у. т и,о продута реакционную смесь выдер i и m Oi о г t ,л г р i l t о ти в течение 90-120 мин

L i i i i i 1 п - и |гз Способ гол 1 обличающийся

г v-it и т шi4-o i i ii iiro при получении цитидинсодержащерсчпгы я пр ) pf п 1 ii i i i чюодукга реакционную смесь выдерживаЛрПГ ПгНО Or; nCi Ч 31Г П Г 01 |5 1ОЧСНИС ММН

изЬ| IT ком т име гиях т ч 1J 1 f j f i и4 Способ поп 1 отличающийся

t и v1 на перед сггрчрп i r rr ь о4 ien что при получении гуанозинсодержап тают по 0 ( 3pV( п цр ч 1lrj iioio продукта реакционную смесь выдерогущостртя См 1Ь 2 к М i r/inn г IT ремчи ают в течение 30-60 мин

т М1ПКО Г РрИС/ld РИИ три ПГ1-

in п юличостге KLI моп ном i fi гн м iТаблица1 Нт iupin прггтчп 1 i j pi it п и i ,ог1ю рррвраше нпя в целевой продукт

Использование: в качестве промежуточных продуктов в синтезе биологически активных веществ и для получения ДНК- и РНК-зондов в медицинской диагностике. Сущность изобретения: продукт:солиN-ацил-или N-а рил дезоксинуклеозид-Б1-фосфатов формулы I: Jwo/ ()jNH vr он где в ia to1 МНСОС6Н5 N N 16 # N К в МНСОСБН5 ,- Лм 15 У NH О NHCCH(CHj)2 выход: 1а, 80,2%; 10, 84%; 1в, 78%. Реагент 1: триметилхлорсилан. Реагент 2: дезокси- нуклеозид, Условия реакции: в среде пиридина, 4-5-кратный избыток реагента 1. Реагент 3: ацил- или арилхлорангидрид соответствующей кислоты. Условия реакции: в среде пиридина при молярном соотношении реагент 3; реагент 2 (2-3):1 с выдерживанием реакционной смеси при комнатной температуре и охлаждением до 0-(-30)°С. Реагент 4: 1,5-2,5 н водный раствор аммиака. Условия реакции: в присутствии триэти- ламина, взятого в эквимолярном количестве к суммарному количеству реагентов 1-3 с выделением целевого продукта обргщенно- фазовой хроматографией. 3 з.п. ф-лы, 9 табл, (Л о С

piivpp

4 b

6

7

f

Т

10 1

Вр°м« р г мин j Дот я превращения в целе

вой продукт

35

,0

ч и

i i i /п

477 660 72 3 83 3 900 95 1 9ЬО

Дтя | в L алевои по j i ктопрс ч } азовси хр if г и рч ии

Таблиц

НПО L С МП pliOMji Fyiirxcr pn

Плмянио npt мс in i г r t. njnib иров 1ччп н i долю поевращонич в целевой продукт Ifl

ВрТЯ р dr Ц 1И МН

Доля превращения в целе вой продукт %

12 13 14 15

Влияние времени изоП.мчонлирог л я i i т,олю превращения в целевой продукт

0

ч и

i /п

рс

477 660 72 3 83 3 900 95 1 9ЬО

ia г еюдпм ммкроколоночнои оЬращенТаблица2

щонич в целевой продукт

Доля превращения в целе- вой продукт %

830 952 96,1 95,5

ТаблицаЗ

Таблица4 Влияние температуры реакционной смеси на долю превращения в целевой продукт

Таблица5 Влияние концентрации аммиака на долю превращения в целевой продукт

Выбор соотношения ацилхлорида к дезоксинуклеотиду

Выбор соотношения триметилхлорсилана к дезоксинуклеотиду

Таблицаб

Таблица

Влмян к ригггиламннч чп г vi i i лггого продукта

Пример

44

45

Успоч1Я 1Г), г(I 3 LI-год ц j|-t lioi о продукта %

Ч rHflLr)/l 1JO l

юг р ш 1°м I PO 2

f ( г ( Г1 I|,ч

74 6

Влияние метода Б п целевого продукта

Пример

Выход цел0 (ескс.ч

flyjiia /о

СО 1

72 2

Таблиц а8

ТаблицаЭ

Bh Liiuui вид целево- го I р од

Gpci4Teuibin гигр по

iрошок

Ги) р порошок с

оггенком кремового UReia (примеси не от деляются)