Способ получения олигодезокситионуклеотидов Советский патент 1982 года по МПК C07H21/04 G01N33/68 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯОЛИГОДЕЗОКСИТИОНУКЛЕОТИДОВ

Изобретение относится к усовер шенствованнрму способу получения олигодезокситионуклеотидов общей формулы где В - тимин, аденин, гуанин, ци п 1-14; R - водород или остаток фосфо Олигодезокситионуклеотиды форм (J) являются биологически актирны соединениями и используются в качестве матриц в РНК-полимеразной системе E.CoPi. Известен способ получения олиг дезокситионуклеотидов формулы (П заключающийся в последовательной обработке литиевой соли 2-дезокси-Нацилнуклеозид (или олиготионуклеотидил)-З -фосфотиоатов мономером - литиевой солью 2, 5-дидeз6кcи-N-aцил5 -йоднуклеозид-3 -Б-р-К,Н-дифенилкарбамоил-(или циан)этилфосфотиоатов или 25-дидезокси-М-ацил-5-йоднуклеозидами в водном диметилформамиде (ДМФА) в осаждении продукта ацетоном, . осадок отделяют центрифугированием, в обработке его щелочью, в экстракции щелочного раствора толуолом с последующей нейтргшизацией катиоиообмениой смолой, в H -форме, во взаимодействии пол5 енного продукта со следующим мономером, в обработке, в случае необходимости, концентрированным аммиаком и в выделении катионообменной хроматографией для получения целевогр продукта, где R - водород. Додекадезокситионуклеотид состава d(GTCCAT) получен с выходами 86-95% на стадию, длительность реакции на одной стадии 2,1 ч, длительность рартвррения реагентов 3,5 ч, средняя длительность стадии 9,6 ч. Длительность первой стадии 3 ч, десятой - 14 ч, что связано с сильным эамедлечием реакции и ухудшением растворимости реагентов в ДМФА С 1 } Недостатками этого способа являются низкая скорость взаимодейст вия реагентов, обусловленная недостаточно высокой реакционной спосо ностью применяемых литиевых солей мономеров как йод-, так и фосфотио атсодержащйх; значительное замедле ние скорости реакции и связанное с этим увеличение затрат времени на одну стадию по мере увеличения дли ны синтезируемого продукта; наличи воды в реакционной среде, приводящее также к уменьшению скорости реа ции; плохая растворимость литиевых солей реагентов в диметилформамиде вызывающая большие затраты времени на их растворение (необходимость пе ремешивания усложняет синтез); необходимость экстракции щелочного раствора толуолом для удаления дифенилакриламида; неоправданно сложное проведение ряда операций, а име но выделение осадка продукта центри фугированием и удаление воды лиофильной сушкой, что усложняет процесс. Целью изобретения является сокра щение затрат времени при синтезе ол годезокситионуклеотидов и упрощение процесса. Поставленная цель достигается те что согласно способу получения олигодезокситионуклеотидов формулы (I ) заключающемуся в. том, что проводят последовательную обработку -тетрабутиламмонийной соли 2-дезокси-Nацилнуклеозид (или олиготионуклеоти дил)-З-фосфотиоата внутренней солью 2, 5 -дидезокси-Ы-ацил-5-йоднук озид-З-S-ji- N-( п-диэтилметиламино) фенилЗкарбамоилэтилфосфотиоата общей формулы 1 0 VCgHt- l где В - тимин, N -анизоилцитозин,. N -бензоиладенин, ы -изобу тирилгуанин, реакцию осуществляют в безводном ДМФА, продукт реакции осаждают раст вором йодистого лития в ацетоне, (осадок фильтруют), осадок обрабатывают щелочью, нейтрализацию щелочного гидролизата продукта проводят путем пропускания через колонку содержащую в верхней части катионообменную смолу в пиридиниевой форме а в нижнё-й части - в тетрабутиламмониевой форме. Полученный продукт подвергают взаимодействию со следующим мономером, обрабатывают, в случае необходимости, концентрированным аммиаком, и выделяют катионообменной хроматографией для получения целевого продукта, где R - водород. Схема реакцииB,O-,/MI «х,о-к. 8 VK х Х 0 ,0-К ° LlOft ОЕ , где В - тимин, N -анизоилцитозин, Ы бензоиладенин, N -изобутирилгуанин;R - Н, остаток фосфотиоатов; R,- Н, олигодезокситионуклертидил;fO , R -CiH4.C-NH-C4H -«(С IL },,СН-, (H-q,Hp)4N.. Средняя длительность реакции 0,08ч, средняя длительность одной стадии 1,3 ч. Пример. 2 -Деаокси-Гцитидилил () -5 -дезокси-5-тио (цитидилил( ) -аденилил- () -тимидилил( ) -дицитидилил- ( ) -тритимидилил- ( ) -дицитидилил- ( ) аденилил- (З-тВ ) -тритимидилил- ( ) гуанозин . 2 -Дезокси (CpsL ApsTps (Cps)2. Aps(Tps)3 . Стадия 1. 2 -Дезокси-Ы -анизоилцитидин-з-фосфотиоат, ди ()-соль (18,8 мг; 0,02 ммоль) и 2,5 дидезокси-5 -йод-К -анизоилцитидин-3-S-}V-CN-(п-диэтилметиламино) фенилJ карбамоилэтилфосфбтиоат (19 мг; 0,024 ммоль) растворяют в безводном .диметилформамиде (0,6 мл) и выдерживают 2 мин. Затем смесь обрабатывают 0,05 М раствором йодистого лития в ацетоне (20 мл), осадок отфильтровывают, промывают ацетоном (25 мл), сушат в вакууме 10 мин. Осадок растворяют в 1 М LiOH (2,0 мл), выдерживают 25 мин и наносят на колонку, содержащую в нижней части дауэкс 50 в Ви 1 форме (1 мл), а в верхней - дауэкс 50 в пиридиниевой форме (3 мл). Смолу элюируют водой (10 мл), элюат продукта упаривают

досуха и используют далее, не очищая, на второй стадии.

Синтез на последующих стадиях 2-15 проводят аналогично стадии 1. Загрузка исходных веществ и время реакции приведены в таблице.

На пятнадцатой стгщии продукт, после осаждения ацетоном, растворяют в 10 мл концентрированного раствора аммиака в воде (осч), выдерживают б ч при 50°С, упаривают аммиак и наносят на колонку с аминохромом С-8О 75 см). Элюируют 0,08 М К ., рН 6,5 (0,5 л), в 9 М мочевине, затем линейным градиентом 0,08+0,11 К в 9 М МОчевине (рН 6,5), объем смесителя и резервуара по 1 л, скорость элюации 90 мл/ч. Продукт выходит при 0,105 М . Соответствующие ему фракции промеряют на спектрофотометре, объединяют, разбавляют в 2 .раза водой и наносят на 1 мл аминохрома С-300. Промывают вОдой, 0,20,4 М бикарбонатом аммония (40 мл), рН 7,0 и затем элюируют продукт 3 мл 1 М бикарбоната аммония (рН 8,5). Раствор упаривают в вакууме и водный раствор окончательно очищают на колонке с сёфадексом G-10 (100 мл), элюируя продукт водой. Фракции, соответствующие пику продукта, пропускают через катионит челекс (Naформа, 1 мл), упаривают и растворяют в 0,3 мл воды. К этому раствору прибавляют ацетон (10 мл), осадок продукта центрифугируют, сушат в вакуум и получают 17 мг (16% в расчете на исходный мономер) пентадека натриевой соли (п). Структуру продукта подтверждают модифицированным методом Сэнжера, подвергая электрофорезу на ацетате целлюлозе его фосфодиэстерозный гидролизат, споследующей гомохроматографией на ТЭАЭ-целлюло.зе при.ЗО ив присутствии меркаптоэтанола, идентификация пятен гомохроматограммы дает структуру C-C-A-T-C-C-T-T-T-C-C-A-T-T-T-G.

Пример2. 2-Дезокси цитиди..,..1-(3- 5)-5-дезокси-5-тиоцитилил -фосфотиоат, 2-дезокси-ы4--анизоилцитидин-з-фосфотиоат, ди- () соль (18,8 мг; 0,02 ммоль) и 2,5- . дидезокси-К -анизоил-5-йодцитидинЗ -S-pr N-(п-дизтилметиламино) фенил карбамоилэтилфосфотиоат (19 мг, 0,024 ммоль) растворяют в безводном диметилформамиде (0,6 мл) и выдерживают 2 мин. (20 мл), осадок отфильтровывают, промывают ацетоном (25 мл), сушат в вакууме 10 мин.

Осадок растворяют в концентрированном аммиаке, выдерживают 6 ч при , упаривают досуха и наносят раствор в 0,1 М бикарбонате аммония, рН 7,5, в 10%-ном спирте (1 мл) на колонку, содержащую 200 мл сефадекса G 25 суперфайн в том же буфере при . Элюцию проводят тем же буфером со скоростью 5 мл/ч. Фракции соответствующие пику продукта, объединяют, упаривают в вакууме, затем трижды с 70%-ным спиртом, водный раствор пропускают через катионит челекс (Na-форма), упаривают досуха и раствор в МеОН (0,3 мл) выливают в эфир (20 мл), осадок отфильтровывают и получают 0,065 г (94%) тринатриевой соли (г) . Вещество гомогенно при ионообменной и гельхроматографии, а также при тех на силуфол в системе хлороформ - метанол- 1 М ацетат аммония (рН 6,5) (10:20:2 v/v УФ-максимум в воде 272 им (18200); УФ-минимум 248 нм ( 12000), содержание тиофосфатных групп 99% по данным йодометрического титрования, что подтверждает структуру Л .

Использование предлагаемого способа получения олигодезокситионуклеотидов обеспечивает по сравнению с известными следующие преимущества: сокращение длительности одной стадии в среднем с 9,6 до 1,3 ч или в 7,4 раза за счет увеличения скорости взаимодействия реагентов в -среднем в 25;раз - 2 ч экономии; увеличение скорости растворения реагентов в среднем в 100 раз - 3,5 ч экономии; исключение экстракций толуолом и фильтрование катионообменной смолы - 0,3 ч экономии; замена центрифугирования и лиофильной сушки на менее длительные и более простые фильтрование и упаривание на ротационном испарителе -2,5ч экономии;

упрощение процесса, заключающееся в исключении механического перемешивания при растворении реагентов за счет применения хорошо растворимых солей последних; упрощении операции щелочного гидролиза за счет применения для нейтрализации щелочи избытка катионита в пиридиниевой форме и проведения ее в колоночном режиме.

Скорость взаимодействия реагентов в предлагаемом способе увеличивается в 10 раз по сравнению с начальной стадией прототипа, но вследствие существенного замедления ее на конечных стадиях в последнем скорость реации увеличивается в среднем в 25 раз Формула изобретения Способ получения олигодезокойтиомуклеотидов общей формулы КО-1/ 4 1 у| т- 0 - В OR 45 где В - тимин, аденин, гуанин, цитозин; п 1-14;. . R - водород, остаток фосфотиоата, заключающийся в последовательной обработке соли 2-дезокси-Ы-ацилнуклеозид (или олиготионуклеотидил)-з-фосфотиоата мономером в диметилформамиде, в осаждении продукта, в обработке его щелочью с последующей нейтрализацией щелочного гидролиза катионообменной смолой, во взаимодействии полученного продукта со.. следующим мономером, в обработке, в случае необходимости, концентрированным аммиаком и выделении катионоОбменной хроматографией для получен целевого продукта, где R - водород отличающийся тем, что, с целью сокращения длительности про цесса и его упрощения, в качестве соли 2-дезокси-Н-ацилнуклеозид(или олиготионуклеотидил)-3-фосфотиоата используют их тетрабутиламмонийную соль, в качестве мономера применяют внутреннюю соль 2, 5-дидезокси. -Ыг-ацил-5-йоднуклеозид-3 8-р- Н-(пдиэтилметиламино)фенил}ке1рбамоилэтилфосфотиоата общей формулы № Ф г/СгНз ЧгН5 0 где В - тимин, N-анизоилцитозин, М бензоиладенин, N -изобутирилгуанин, реакцию проводят в безводном диметилформамиде, продукт реакции осаждают раствором йодистого лития в ацетоне, а нейтрализацию щелочного гидролиэата продукта проводят путем пропускания через, колонку, содержащую В верхней части катионообменную смол в пиридиниевой форме,, а в нижней части - в тетрабутиламмонийной форме. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Авторское свидетельство СССР по заявке 2798760/04, кл. С 07 Н 19/06, 1979 (прототип) .