Индикаторное тест-устройство для определения концентраций субстратов ферментативных реакций Советский патент 1992 года по МПК C12Q1/26 

любой конструкции, используемая для герметизации реагентов внутри капсулы в процессе проведения анализа,

Капсула может быть изготовлена из лю- хбого термостойкого прозрачного материала, например, стекла или пластмассы. Размеры капсулы, за исключением ее внутреннего диаметра, не имеют принципиального значения. Внутренний диаметр определяет количество субстрата, поступившего из образца в капсулу. Каждую часть капсулы используют для формирования в ней слоя для нанесения образца либо реакционного слоя, либо для хранения реагентов, не вошедших в реакционный слой. Выбор хранения реагентов в сухом виде или помещение их в реакционный слой, равно как и количество реакционных слоев, зависящее от числа реагентов, определяется условиями, необходимыми для длительной сохранности реагентов, и условиями проведения реакции. Формирование указанных слоев проводят на основе соединений, образующих при температуре до 30°С истинные студни, способных изменять свое агрегатное состояние в зависимости от температуры /гель-раствор/. К таким соединениям относятся желатина, агар-агар, поливиниловый спирт, метил целлюлоза и некоторые другие. Так, например, при температуре до 30°С 10% раствор желатины представляет собой студень, а с повышением температуры легко расплавляется с образованием раствора, в котором коэффициент диффузии низкомолекулярных соединений практически не отличается от коэффициента диффузии в воде.

Определение концентраций субстратов ферментативных реакций с помощью индикаторных тест-капсул проводят следующим образом: на слой для нанесения образца помещают на определенное время несколько капель исследуемого раствора. В течение этого времени в слой студня происходит диффузия низкомолекулярных соединений и. в частности, анализируемого соединения. Количество продиффундировавшего субстрата будет прямо пропорционально его концентрации в образце /и диаметру части капсулы, содержащей слой для нанесения образца/, который удаляют смыванием мягкой струей воды или встряхиванием. Капсулу герметизируют, соединяя с другими ее частями, содержащими реакционные слоя и реагенты, и помещают в теплую воду /с температурой не ниже 37° С и не выше 60°С/, В результате чего студень расплавляется, слой для нанесения образца и реакционные слои смешиваются, растворяя сухие реагенты, что инициирует ферментативную

реакцию. Через 5-15 мин после начала реакции производят сравнение окраски индикаторной тест-капсулы со стандартной шкалой.

Пример 1. Индикаторные тест-капсулы для определения концентрации глюкозы. Приготовление реакционного слоя: 1 г желатины, 20 мг глюкозооксидазы, 10 мг фенола, 20 мг пероксидазы, 20 мг 4-аминоантипирина и 10 мг азида натрия растворяют при 40-45°С в 10 мл фосфатного буферного раствора /0,05 М рН 7,2/. 100 мкл приготовленного раствора помещают в одну из половин индикаторной тест-капсулы /высота 15 мм, внутренний диаметр 4 мм/.

Приготовление слоя для нанесения образца: 1 г желатины, 10 мг фенола и 10 мг азида натрия растворяют при 40-45°С в 10

мл фосфатного буферного раствора /0,5 М рН 7,2/. 100 мкл приготовленного раствора помещают в другую половину /высота 10 мм, внутренний диаметр 4 мм/ индикаторной тест-капсулы.

Определение концентраций глюкозы с помощью индикаторных тест-капсул проводят следующим образом: в анализируемый раствор помещают на 2 мин половину капсулы, содержащую слой для нанесения образа. Через указанный интервал времени

эту часть капсулы извлекают, промывают водои, соединяют с другой половиной,

содержащей реакционный слой, и помещают

в термостат /50°С/ на 10 мин, после чего

сравнивают окраску капсулы со стандартной шкалой, изготовленной при использовании калибровочных растворов. Диапазон анализируемых визуально /по интенсивности окраски/ концентраций глюкозы с помощью приготовленных таким образом индикаторных тест-капсул составляет 5-26 мМ.

Материал, из которого изготовлены тест-капсулы - стекло. Герметизацию капсулы осуществляют с помощью небольших

трубочек /длиной не более 4 мм/, полученных разрезанием силиконового шланга, которые плотно одевают на обе половинки капсулы при соединении их торцами.

П р и м е р 2. Индикаторные тест-капсулы для определения концентрации этилового спирта.

Приготовление реакционного слоя: 1 г желатины, 20 мг алкогольоксидазы, 10 мг

фенола, 20 мг пероксидазы, 20 мг 4-амино- антипирина, 10 мг азида натрия и 10 мг семикарбазида растворяют при 40-45°С в 10 мл фосфатного буферного раствора /0,2 М рН 7,8/, содержащего 1 мМ ЭДТА. 100 мкл

приготовленного раствора помещают в одну из половин индикаторной тест-капсулы /высота 15 мм, внутренний диаметр 4 мм/.

Конструкция тест-капсулы, состав слоя для нанесения образца и последовательность операций при выполнении определения аналогичны примеру 1.

Пример 3. Индикаторное тест-капсулы для определения концентрации мочевины.

Приготовление реакционного слоя: 0,1 г агар-агара, 170 мг уреазы, 20 мг бромтимо- лового синего, 15 мг азида натрия растворяют при 50°С в 10 мл аммоний-цитратном буферном расторе /0,01 М рН 6,5/, содержащем 1мМ ЭДТА, 100 мкл приготовленного раствора помещают в одну из половин /высота 15 мм, внутренний диаметр 4 мм/ индикаторной тест-капсулы,

Приготовление слоя для нанесения об- разца: 0,1 г агар-агара и 15 мг азида натрия растворяют при 50°С в дистиллированной воде /с помощью слабого раствора щелочи рН воды доводят до 6,2/объемом 10мл 100 мкл приготовленного раствора помещают в другую часть капсулы /высота 10 мм, внутренний диаметр 4 мм/,

Конструкция тест-капсулы и последовательность операций при выполнении определения аналогичны примеру 1, Переход от светло-зеленого до синего окрашивания коррелирует с изменением концентрации мовечины в образце в диапазоне 2-13 мМ.

П р и м е р 4, Индикаторные тест-капсулы для определения концентрации этанола.

Приготовление слоя для нанесения образца: 0,1 г агар-агара и 10 мг азида натрия растворяют при 50°С мл глицин - NaOH буферного раствора /0,5 М рН 9,4/. 200 мкл приготовленного раствора помещают в одну из половин индикаторной тест-капсулы /высота 25 мм, внутренний диаметр 4 мм/.

Приготовление 1-го реакционного слоя: 0,1 г агар-агара, 10 мг никотинамидадениндинуклеотида и 10 мг азида натрия растворяют при 50°С в 10 мл глицин-НС буферного раствора /0.02 М рН 3,5/. ЮОмкл приготовленного раствора помещают в другую половину индикаторной TCCI с-шсулы

/высота 10 мм, внутренний диаметр 4 мм/.

Приготовление 2-го реакционного слоя:

20 мг диафоразы /НАДН-дегидрогеназы/,

10 мг тетразолия, 10 мг семикарбэзида, 20

мг алкогольдегидрогеназы и 10 мгаэидакатрия растворяют при 45 °С в 10 мл 1 % раствора агар-агара, приготовленного на основе фосфатного буфера /0,02 М рН 7,0/. 100 мил раствора помещают в среднюю часть капсулы /высота 10 мм, внутренний

диаметр 4 мм/, которая представляет собой стеклянную трубку указанных размеров, закрывающуюся с обеих сторон небольшими пробками. Аналогичные пробки закрывают также и две другие части капсулы при ее

хранении, транспортировке, что предупреждает механическое повреждение слоев, их зарастание и загрязнение.

Формула изобретения

Индикаторное тест-устройство для определения концентраций субстратов фер- - ментативных реакций, состоящее из подложки, одного или нескольких слоев реагентов и слоя для нанесения анализируемого образца, отличающееся тем, что, с целью упрощения технологии изготовления и снижения себестоимости., подложка представляет собой разьемную капсулу, оы- пролненную по крайней мере из двух частей

и из прозрачного термостойкого материала, слой для нанесения образца выполнен на основе истинного студня и размещен в одной из частей капсулы, а слои реагентов, один или несколько из которых выполнены

также на основе истинных студней, размещены в других частях капсулы.

Изобретение относится к аналитической биохимии и может быть использовано в клинических исследованиях, в пищевой и микробиологической промышленности, бродильном производстве. Цель изобретения -снижение себестоимости и упрощение технологии изготовления индикаторного тест-устройства. Индикаторное тест-устройство для определения концентраций субстратов ферментативных реакций представляет собой капсулу, выполненную из прозрачного термостойкого материала, составные части которой содержат слой истинного студня для нанесения образца и Изобретение относится к области аналитической биохимии и может быть использовано в клинических исследованиях, а пищевой и микробиологической промышленности, бродильном производстве. Цель изобретения - упрощение технологии изготовления и снижение себестоимости. Индикаторное тест-устройство выполнено в виде капсулы, в которой слой для реагенты, которые также могут быть включены в студень. Причем слой для нанесения образца и слой студня, содержащий реагенты, пространственно отделены друг от друга и находятся в разных частях капсулы. После контакта с исследуемым образцом в течение нескольких минут части капсулы, содержащей слой для нанесения образца, капсулу герметизируют и опускают в теплую воду, температура которой не превышает 60°С. За несколько минут пребывания в таких условиях студни, находящиеся в капсуле, расплавляются, смешиваются, что инициирует протекание реакции, сопровождающейся изменением цветности. Визуальная оценка интенсивности окраски позволяет судить о концентрации анализируемого соединения в исследуемой пробе с ошибкой не более 25%. В случае применения фотометра с помощью индикаторной тест-капсулы можно проводить количественный анализ. Для формирования студней используют желатину, агар-агар и некоторые другие соединения. Конструкция индикаторныхтест-капсул фактически позволяет реализовать любой спектрофотометрический способ анализа субстратов ферментативных реакций. 3 ил. нанесения образца пространственно отделен от реагентов, причем некоторые из реагентов, как и слой для нанесения образца, выполнены на основе истинных студней. Устройство индикаторной тест-капсулы показано на фиг. 1 и 2, где 1 - части капсулы, 2 - крышки, используемые для герметизации реагентов внутри частей капсулы при транспортировке иди хранении. На фиг. 3 показана капсула в сборе, где 1 - манжета Ё «.„А Ч О 00 о N N5

l/Cf77W6/t/

c/vfftfef/b

Фиг. 4

Т

фиг. 2

-г

I I I

..