Штамм дрожжей РIснIа pINUS - продуцент алкогольоксидазы Советский патент 1992 года по МПК C12N1/16 C12N9/04 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается штамма метилотроф- ных дрожжей Pichia pinus AOC-3, способного секретировать алкогольоксида- зу в среду.

Алкогольоксидаза - фермент, катализирующий окисление кислородом воздуха ме- танола, этанола и некоторых других первичных спиртов до соответствующих альдегидов с образованием перекиси водорода (1).

Наиболее близким к предлагаемому является получения препаратовалкогольокси- дазы при помощи штамма Hansenula polymorpha CBS 4732, при котором разрушение клеточной стенки дрожжей достигается путем инкубации клеток с раствором литического фермента зимолиазы (2). Зимо- лиаза является дорогостоящим ферментом; для получения активных препаратов алко- гольоксидазы необходимо удалять присутствующую в получаемых бесклеточных экстрактах каталазу. Все указанные недостатки могли бы быть устранены при обнаружении штаммов, секретирующих алко- гольоксидазу (но не каталазу) в среду.

Целью изобретения является выделение штаммов метилотрофных дрожжей, секретирующих алкогольоксидазу в среду.

Предлагается новый штамм метилотрофных дрожжей Pichia pinus AOC-3, секре- тирующий алкогольоксидазу (но не каталазу) в среду.

Штамм дрожжей P.pinus AOC-3 получен при помощи многостадийного мутагенеза штамма P.pinus MH 4 дикого типа с использованием специальных селекционных приемов.

Предлагаемый штамм P.pinus AOC-3 хранится в коллекции отдепа биохимической генетики Львовского отделения Института биохимии им. А.В.Палладина АН УССР и депонирован в Центральном музее промышленных микроорганизмов во ВНИИ Генетика (коллекционный номер Y-928).

сл

С

vj vi о

со сл

м

Условия культивирования и накопления алкогольоксидазы в культуральной жидкости и в клетках штамма АОС-3 представлены следующим примером.

Пример.

Штамм P.pinus АОС-3 выращивают до середины экспоненциальной фазы роста (до биомассы клеток 1 мг сухого веса/1 мл среды) в среде следующего состава (из расчета на 1 л среды): метанол - 10 мл, мочевины - 3 г, КНг Р04 - 8 г, N32HP04 - 12, 43 г, MgSCM 7Н20 - 0,5 г, CaCI - 0,1 г, дрожжевой экстракт - 0,5 г, рН среды - 6,4. Мочевину в виде 30%-го водного раствора стерилизуют автоклавированием отдельно от питательной среды. После стерилизации в среду до- бавляют мочевину и метанол. Культивирование ведут на качалке (200 об/мин) при 30°С в течение 54 часов в колбах объемом 750 мл, содержащих 200 мл питательной среды. Клетки осаждают центрифугированием, затем определяют активность алкогольоксидазы в культуральной жидкости и пермеабилизированных дигито- нином клетках. В указанных условиях активностьалкогольоксидазывпермеабилизированных клетках составляет 116.0 нмоль -мин -мг клеток, а в культуральной жидкости - 0.08 ед/мл или 2,91 ед/мг белка культуральной жидкости, т.е. в среду культивирования секретируется 44,7% от общего количества синтезируемой в клетке алкогольоксидазы. Активность ка- талазы не обнаруживается в культуральной жидкости.

Концентрация белка в культуральной жидкости, которую определяют после диализа против 10 мМ КНаРСЦ/МаОН буфера рН 7,5 (при 4°С в течение 4 часов) методом Бредфорда, составляет 211 мкг/мл. Активность алкогольоксидазы в диализирован- ной культуральной жидкости равна 2,01 мкмоль мин -мг белка. Культуральную жидкость колнцентрируют следующим образом: 4 мл этой жидкости в диализном мешке помещают в стакан, содержащий 20 г полиэтиленгликоля с молекулярной массой 20000 (ПЭГ-20000) и инкубируют 6 часов при температуре 4°С. При этом достигается уменьшение объема культуральной жидкости до 0,1 мл, т.е. концентрирование этой жидкости в 40 раз. Концентрированную культуральную жидкость подвергают электрофорезу в 7,5%-ом полиакриламидном геле в нативных условиях при напряжении 200 В и силе тока 24 мА. При окрашивании элек- трофореграммы с целью детекции белка и активности алкогольоксидазы выявляется одна белковая зона, Rf которой равен Rf

алкогольоксидазы, что указывает на гомогенность препарата этого фермента, секре- тируемого клетками штамма.

Морфолого-культуральные свойства.

Вегетативные клетки при выращивании

на агаризованном сусле плотность 8°Б при 30°С в течение 2-3 суток имеют круглую или овальную форму размером (2,8-4,5) х (3,9- 6,0) мкм. Клетки одиночные, редко встреча0 ются небольшие скопления из 2-3 клеток. Размножение почкованием. В основном расположение почек апикальное. Мицелий или псевдомицелий культура не образует, капсула отсутствует. Включения при про5 смотре в световом микроскопе выражено слабо. Реакция с диазонием синим отрицательная. Вегетативные споры не образует. Культура гомоталличная. При длительном культивировании на сусло-агаре (более 2-х

0 недель) около 1-2% клеток подвергаются пламогамии и кариогамии с последующим спорообразованием. При споруляции образуются аски с 2-4 шляповидными гаплоидными аскоспорами, что сопровождается

5 накоплением в колонии бурого пигмента.

На сусло-агаре после 2-3 суток культивирования при 30°С колонии и штрих белые, выпуклые, слегка матовые, с ровными краями, сметанообразной консистенции, легко

0 снимаются петлей.

В жидкой среде при выращивании на солодовом сусле плотностью 8°Б при 30°С в статических условиях на 2-3 сутки образуется кольцо и островки очень тонкой пленки,

5 а затем осадок клеток белого цвета. При выращивании культуры в указанных условиях на качалке рост отмечается в виде помутнения среды. Окрашивание среды при культивировании не наблюдается.

0 Физиолого-биохимические свойства.

Тип катаболизма: дыхание. Аэроб. Максимальная температура для роста 33°С, оптимальная температура 30°С, минимальная температура 10°С. Максимум рН для роста

5 6,8, оптимум - 5,4, минимум - 4,3. Культура осмотолерантна: растет в присутствии 1 М сорбита. Культура обладает незначительной галотолерантностью: в среде с 10% NaCk рост слабый. Рост чувствителен кантимици0 ну А и нистатину, резистентен к циклогекси- миду. ампициллину, тетрациклину. .

В жидкой и плотной среде указанного в примере состава штамм хорошо утилизирует следующие источники углерода: глюкозу,

5 маннозу, маннит, фруктозу, ксилозу, L-apa- бинозу, целлобиозу, фумаровую кислоту, янтарную кислоту, этанол и метанол, плохо утилизирует мальтозу, раффинозу, рибозу, лимонную кислоту, яблочную кислоту, сорбит, ксилит, не утилизирует трегалозу, щавелевоуксусную кислоту, D-арабинозу, гли- церальдегид, дульцит, L-сорбозу. В качестве источников азота в жидкой и плотной среде указанного в примере состава штамм хорошо усваивает соли аммония, а в той же среде без ( также хорошо утилизирует глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, глутамин, аспарагин, пролин, метиламин и D-аланин, плохо утилизирует D-ce- рин и мочевину, не утилизирует нитраты.

Рост штамма в синтетических средах абсолютно зависит от наличия биотина, тиамин частично стимулирует рост. При росте в среде с глюкозой штамм характеризуется отсутствием алкогольоксидазной активно- сти, при росте в среде с метанолом активность алкогольоксидазы в клетках мутанта высокая. При выращивании в среде с метанолом мутантный штамм, в отличие от исходного штамма P.pinus MH4, секретирует

алкогольоксидазу. Штамм является протот- рофом.

Клетки штамма не содержат плазмид. % Гц пар составляет 39,1 %.

Штамм является не патогенным в опытах не белых мышах.

Штамм P.pinus AOC-3 необходимо хранить на скошенном сусло-агаре при 4УС, пересевы производить через 3-4 месяца.

Использование штамма позволит наладить в СССР биотехнологическое производство препаративных количеств алкогольоксидазы, используя гораздо более эффективную, по сравнению с используемыми в настоящее время за рубежом, процедуру выделения этого фермента.

Формула изобретения Штамм дрожжей Pichia pinus ВКП.М У- 928-продуцент алкогольоксидазы.

Использование: биотехнология. Сущность изобретения. В результате многостадийного мутаненеза штамма Pichia pinus МНЧ дикого типа получен штамм Pichia pinus ВКПМ У-928, отличающийся от исходного штамма культурально-морфологиче- скими признаками и требующий для оптимального биосинтеза алкогольоксида- зы наличия в среде биотина и метанола. Удальная активность внеклеточной алго- кольоксидазы составляет 0,09 ед/мг клеток, 0,08 ед/мл культуральной жидкости, или 2,91 ед/мг белка культуральной жидкости.