Штамм метилотрофных дрожжей HaNSeNULa роLYмоRрна-продуцент алкогольоксидазы на среде с глюкозой Советский патент 1993 года по МПК C12N9/04 C12N1/16 

.Изобретение относится к биотехнологии, а именно к микробиологической промышленности,икасается штамма-продуцента алкогольоксидазы с конститутивным синтезом этого фермента.

Цель изобретения - получение штамма, обеспечивающего синтез алкогольоксидззы в средах, содержащих глюкозу, т.е. нечувствительного к глюкозной катаболитной репрессии и обладающего конститутивным типом синтеза фермента. .

Штамм Hansenula polymorpha KCA-33 получен из штамма 22 (leu-10) генетической линии (Шеффилдский университет, Англия), который хранится в музее Львовского отделения Института биохимии им. А.В.Палладина, путем направленного мутагенеза под воздействием УФ-лучей. При мутагенезе используют дозу, обеспечивающую 10%-ное выживание клеток. Отбирают мутанты исходного штамма, резистентные при росте в среде с 1 %-иым метанолом к 2-дезоксиглю- козе (20 мг/л) и дающие б-viee высокий уровень алкогольоксидазы при росте в среде с 1 %-ной глюкозой.

Полученный штамм дрожжей Hansenula polymorpha KCA-33 депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов при ВНИИГенетика под номером; ВКПМУ-1345.

Штамм Hansenula polymorpha KCA-33 (ВКПМУ-1345) характеризуется следующими культурально-морфологическими и физи- олого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

00

со го

ю

00

Вегетативные клетки при выращивании а сусло-агаре плотностью 8°Б при 37°С в ечение 2-3 сут имеют круглую форму или пальную размером (1,5-4,6) х (1,9-5,3) мкм, Клетки одиночные, редко встречаются неольшие скопления из 2-3 клеток. Размноение почкованием. В основном расположение почек апикальное. Мицелий ли псевдомицелий культура не образует, апсула отсутствует. Включения при про- мотре в световом микроскопе выражены лабо. Реакция с диазонием синим отрицаельная.

На сусло-агаре после 2-4 сут культивирования при 27, 30 и 37°С колонии и штрих сэатло кремовые, выпуклые, блестящие с ровными краями,.сметанообразной консистенции, легко снимается петлей,

В жидкой среде при выращивании на солодовом еусяе плотностью 8°Б при 37°С в статических условиях на 2-3 сут образуется кольцо и островки очень тонкой пленки, а затем осадок клеток слегка кремового цве-- та.. При выращивании культуры в указанных условиях на качалке рост отмечается в виде помутнения среды,

. Культура способна к спариванию и спо- руляции,

. Физиологр-биохимические признаки,

Аэроб.

Температурный диапазон роста 10- 42°С, оптимальная температура 37°С,

Оптимум рН для роста 5,5. Культура растет в присутствии 1 М сорбита, В среде с 10% NaCI рост слабый.

Чувствителен к циклогексимиду, анти- мицину А, нистатину. Резистентен к ампициллину, тетрациклину.

Отношение к источникам углерода: хорошо утилизирует глюкозу, мальтозу, рибо- зу, эритрол, рибитол, глицерин, этанол, метанол, маннит, плохо утилизирует ксилозу, сахарозу, рамнозу, лимонную кислоту, янтарную кислоту, не утилизирует галактозу, лактозу, раффинозу, арабинозу, крахмал.

Как источники азота хорошо усваивает сопи аммония и нитраты,

«Рост штамма в синтетических средах абсолютно зависит от наличия биотина, тиамин частично стимулирует рост.

Клетки штамма не содержат плазмид. % ГЦ пар составляет 48%.

Штамм не токсичен в опытах на белых мышах.

Штамм хранится на скошенном сусло- агаре при 4°С, пересевы следует производить через 3-4 мес.

Штамм отличается от исходного или близких штаммов способностью синтезировать злкогольоксидазу при росте на среде с

глюкозой, т.е. не чувствителен к глюкоэной катаболитной репрессии и не требует метанола как индуктора (другими словами, обладает способностью к конститутивному

синтезу алкогольоксидазы). Продуктивность штамма на среде с глюкозой составляет 0,20-0,25 мкмоль/мин на 1 мг сухого веса клеток или 1,5-1,8 мкмоль/мин на 1 мг белка бесклеточного экстракта.

Сущность изобретения поясняется конкретными примерами использования штамма Hansenula polymorpha КСА-33 (ВКПМ № Y-705).

П р.и м е р 1. Штамм выращивают до

поздней экспоненциальной или начала стационарной фазы (биомасса 1,3-2,0 мг/сухо- го веса клеток в 1 мл) в среде следующего состава (из расчета на 1 л среды), г: КНаР04 1 г; (NH4)aS04 3,5;MgS04 7Н20 0,5; CaCIa

о,1; дрожжевой экстракт 0,5 г; глюкоза 10 г. Культивирование ведут на качалке (200 об/мин) при 30-37°С в течение 2-3 сут. Клетки осаждают центрифугированием, промывают водой и хранят на холоду. Биомассу (в мг сухого веса в 1 мл) определяют фотометрически с предварительной гравиметрической калибровкой.

Активность алкогольоксидазы определяют в пермеабилизированных дигитонином (1 мг/мл, 15 мин при 30°С) клетках следующим образом.В субстратную смесь состава 0,3 мМ о-дианизидин в 100 мМ фосфатном буфере, рН 7,5-2,5 мл, 0,1 % раствор пероксидазы хрена (RZ 0,6 Реанал) 0,2

суспензия пермеабилизованных и отмытых клеток (с 0,2-0,5 мг/сухого веса в 1 мл) - 0,15 мл прибавляли 0,15 мл 200 мМ метанола (запуск реакции). Смесь инкубировали при 30°С 5-20 мин и реакцию останавливали прибавлением 0,8 мл конц. HCI. Пробы центрифугировали (3 тыс. об/мин 5-10 мин) и супернатанты фотометрировали в Тсм-кю- ветах при 525 нм против контроля, несодержащего метанола.

Удельную активность алкогольоксидазы в мкмоль/мин на 1 мг сухого веса клеток

рассчитывали по формуле

50

Ауд

D 0.284 п 0,15 -t С

где D - оптическая плотность пробы при 525 нм; - время реакции, мин;

С - исходная концентрация суспензии пермеабилизованных клеток мг/мл;

п - разведение этой суспензии перед анализом алкогольоксидэзы;

5 18321286

0,15 - объем вносимой в реакционную5 мин при охлаждении. Бесклеточный экс- смесь суспензии клеток, мл;тракт отделяют от клеточных осколков цен0,284 - калибровочный коэффициент.трифугированием при 1200 об/мик в

Продуктивность штамма (т.е. актив-течение 0,5 ч. Определяют содержание белность элкогольоксидазы) в данных условиях5 ка в экстракте по методу Лоури и активность

выращивания составила 0,180-0,2.00алкогольоксидазы, как описано в примере 1,

мкмоль/мин на 1 мг клеток, что в 2000 разв случае пермеабилизованных клеток. Аквыше, чем в случае штамма-прототипа 1031тивность алкогольоксидазы 1,5-1,8

P. pinus, выращенного на глюкозной среде.мкмоль/мин на 1 мг белка.

Г) р и м е р 2. Условия выращивания - как10 Формула изобретения

в примере 1. Отмытые клетки (концентрацияШтамм метилотрофных дрожжей

50-100 мг/мл) дезинтегрируют при 1000Hansenula polymorpha ВКПМ Y-1345 - прооб/мин с помощью стеклянных бус 00,45-дуцент алкогольоксидазы на среде с глюко0,50мм в соотношении 1.5:1 на протяжениизой.

Использование: в биотехнологий, а именно в микробиологической промышленности, и касается штамма-продуцента алкогольокси- дэзы с конститутивным типом синтеза этого фермента. Сущность изобретения: получен штамм Hansenula polymorpha BKI1MY1345 нечувствительный к глюкозной катаболитной репрессии и не требующий для экспрессии гена алкогольоксидазы индуктора (т.е. обладающего свойством конститутивного синтеза .фермента при росте на среде с глюкозой). Штамм продуцирует при росте на среде с глюкозой алкогольоксидазу с активностью около 0,20-0,25 мкмоль/мин на 1 мг сухой массы клеток или 1,5-1,8 мкмоль/мин на 1 кг белка в бесклеточном экстракте.