.Изобретение относится к биотехнологии, а именно к микробиологической промышленности,икасается штамма-продуцента алкогольоксидазы с конститутивным синтезом этого фермента.
Цель изобретения - получение штамма, обеспечивающего синтез алкогольоксидззы в средах, содержащих глюкозу, т.е. нечувствительного к глюкозной катаболитной репрессии и обладающего конститутивным типом синтеза фермента. .
Штамм Hansenula polymorpha KCA-33 получен из штамма 22 (leu-10) генетической линии (Шеффилдский университет, Англия), который хранится в музее Львовского отделения Института биохимии им. А.В.Палладина, путем направленного мутагенеза под воздействием УФ-лучей. При мутагенезе используют дозу, обеспечивающую 10%-ное выживание клеток. Отбирают мутанты исходного штамма, резистентные при росте в среде с 1 %-иым метанолом к 2-дезоксиглю- козе (20 мг/л) и дающие б-viee высокий уровень алкогольоксидазы при росте в среде с 1 %-ной глюкозой.
Полученный штамм дрожжей Hansenula polymorpha KCA-33 депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов при ВНИИГенетика под номером; ВКПМУ-1345.
Штамм Hansenula polymorpha KCA-33 (ВКПМУ-1345) характеризуется следующими культурально-морфологическими и физи- олого-биохимическими признаками.
Культурально-морфологические признаки.
00
со го
ю
00
Вегетативные клетки при выращивании а сусло-агаре плотностью 8°Б при 37°С в ечение 2-3 сут имеют круглую форму или пальную размером (1,5-4,6) х (1,9-5,3) мкм, Клетки одиночные, редко встречаются неольшие скопления из 2-3 клеток. Размноение почкованием. В основном расположение почек апикальное. Мицелий ли псевдомицелий культура не образует, апсула отсутствует. Включения при про- мотре в световом микроскопе выражены лабо. Реакция с диазонием синим отрицаельная.
На сусло-агаре после 2-4 сут культивирования при 27, 30 и 37°С колонии и штрих сэатло кремовые, выпуклые, блестящие с ровными краями,.сметанообразной консистенции, легко снимается петлей,
В жидкой среде при выращивании на солодовом еусяе плотностью 8°Б при 37°С в статических условиях на 2-3 сут образуется кольцо и островки очень тонкой пленки, а затем осадок клеток слегка кремового цве-- та.. При выращивании культуры в указанных условиях на качалке рост отмечается в виде помутнения среды,
. Культура способна к спариванию и спо- руляции,
. Физиологр-биохимические признаки,
Аэроб.
Температурный диапазон роста 10- 42°С, оптимальная температура 37°С,
Оптимум рН для роста 5,5. Культура растет в присутствии 1 М сорбита, В среде с 10% NaCI рост слабый.
Чувствителен к циклогексимиду, анти- мицину А, нистатину. Резистентен к ампициллину, тетрациклину.
Отношение к источникам углерода: хорошо утилизирует глюкозу, мальтозу, рибо- зу, эритрол, рибитол, глицерин, этанол, метанол, маннит, плохо утилизирует ксилозу, сахарозу, рамнозу, лимонную кислоту, янтарную кислоту, не утилизирует галактозу, лактозу, раффинозу, арабинозу, крахмал.
Как источники азота хорошо усваивает сопи аммония и нитраты,
«Рост штамма в синтетических средах абсолютно зависит от наличия биотина, тиамин частично стимулирует рост.
Клетки штамма не содержат плазмид. % ГЦ пар составляет 48%.
Штамм не токсичен в опытах на белых мышах.
Штамм хранится на скошенном сусло- агаре при 4°С, пересевы следует производить через 3-4 мес.
Штамм отличается от исходного или близких штаммов способностью синтезировать злкогольоксидазу при росте на среде с
глюкозой, т.е. не чувствителен к глюкоэной катаболитной репрессии и не требует метанола как индуктора (другими словами, обладает способностью к конститутивному
синтезу алкогольоксидазы). Продуктивность штамма на среде с глюкозой составляет 0,20-0,25 мкмоль/мин на 1 мг сухого веса клеток или 1,5-1,8 мкмоль/мин на 1 мг белка бесклеточного экстракта.
Сущность изобретения поясняется конкретными примерами использования штамма Hansenula polymorpha КСА-33 (ВКПМ № Y-705).
П р.и м е р 1. Штамм выращивают до
поздней экспоненциальной или начала стационарной фазы (биомасса 1,3-2,0 мг/сухо- го веса клеток в 1 мл) в среде следующего состава (из расчета на 1 л среды), г: КНаР04 1 г; (NH4)aS04 3,5;MgS04 7Н20 0,5; CaCIa
о,1; дрожжевой экстракт 0,5 г; глюкоза 10 г. Культивирование ведут на качалке (200 об/мин) при 30-37°С в течение 2-3 сут. Клетки осаждают центрифугированием, промывают водой и хранят на холоду. Биомассу (в мг сухого веса в 1 мл) определяют фотометрически с предварительной гравиметрической калибровкой.
Активность алкогольоксидазы определяют в пермеабилизированных дигитонином (1 мг/мл, 15 мин при 30°С) клетках следующим образом.В субстратную смесь состава 0,3 мМ о-дианизидин в 100 мМ фосфатном буфере, рН 7,5-2,5 мл, 0,1 % раствор пероксидазы хрена (RZ 0,6 Реанал) 0,2
суспензия пермеабилизованных и отмытых клеток (с 0,2-0,5 мг/сухого веса в 1 мл) - 0,15 мл прибавляли 0,15 мл 200 мМ метанола (запуск реакции). Смесь инкубировали при 30°С 5-20 мин и реакцию останавливали прибавлением 0,8 мл конц. HCI. Пробы центрифугировали (3 тыс. об/мин 5-10 мин) и супернатанты фотометрировали в Тсм-кю- ветах при 525 нм против контроля, несодержащего метанола.
Удельную активность алкогольоксидазы в мкмоль/мин на 1 мг сухого веса клеток
рассчитывали по формуле
50
Ауд
D 0.284 п 0,15 -t С
где D - оптическая плотность пробы при 525 нм; - время реакции, мин;
С - исходная концентрация суспензии пермеабилизованных клеток мг/мл;
п - разведение этой суспензии перед анализом алкогольоксидэзы;
5 18321286
0,15 - объем вносимой в реакционную5 мин при охлаждении. Бесклеточный экс- смесь суспензии клеток, мл;тракт отделяют от клеточных осколков цен0,284 - калибровочный коэффициент.трифугированием при 1200 об/мик в
Продуктивность штамма (т.е. актив-течение 0,5 ч. Определяют содержание белность элкогольоксидазы) в данных условиях5 ка в экстракте по методу Лоури и активность
выращивания составила 0,180-0,2.00алкогольоксидазы, как описано в примере 1,
мкмоль/мин на 1 мг клеток, что в 2000 разв случае пермеабилизованных клеток. Аквыше, чем в случае штамма-прототипа 1031тивность алкогольоксидазы 1,5-1,8
P. pinus, выращенного на глюкозной среде.мкмоль/мин на 1 мг белка.
Г) р и м е р 2. Условия выращивания - как10 Формула изобретения
в примере 1. Отмытые клетки (концентрацияШтамм метилотрофных дрожжей
50-100 мг/мл) дезинтегрируют при 1000Hansenula polymorpha ВКПМ Y-1345 - прооб/мин с помощью стеклянных бус 00,45-дуцент алкогольоксидазы на среде с глюко0,50мм в соотношении 1.5:1 на протяжениизой.
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
Штамм дрожжей РIснIа pINUS - продуцент алкогольоксидазы | 1989 |
|
SU1770357A1 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДРОЖЖЕВОЙ АЛКОГОЛЬОКСИДАЗЫ | 1990 |
|
RU2032743C1 |
Штамм дрожжей HaNSeNULa роLYмоRрна -биотрансформатор метанола в формальдегид | 1987 |
|
SU1634709A1 |
Рекомбинантный штамм дрожжей Ogataea haglerorum - продуцент фитазы Escherichia coli | 2021 |
|
RU2785901C1 |
КЛЕТКА МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА Penicillium canescens - ПРОДУЦЕНТ КСИЛАНАЗЫ И ЛАККАЗЫ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМБИНИРОВАННОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА КСИЛАНАЗЫ И ЛАККАЗЫ | 2012 |
|
RU2538149C2 |
ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ УЛУЧШЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ МИНИМИЗАЦИИ ПРОДУКЦИИ АКРИЛАМИДА | 2011 |
|
RU2603061C2 |
ИНДУЦИРУЕМЫЙ ТЕПЛОМ ПРОМОТОР И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ | 2000 |
|
RU2230786C2 |
Трансформант дрожжей Ogataea haglerorum - продуцент фитазы Escherichia coli | 2021 |
|
RU2771079C1 |
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА, КОДИРУЮЩАЯ ПОВЕРХНОСТНЫЙ АНТИГЕН (HBSAG) ВИРУСА ГЕПАТИТА B, ЕЕ ПОЛУЧЕНИЕ И ШТАММ ДРОЖЖЕЙ HANSENULA POLYMORPHA - ПРОДУЦЕНТ ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА (HBSAG) ВИРУСА ГЕПАТИТА B | 2002 |
|
RU2207374C1 |
Питательная среда для выращивания продуцента @ - @ -амино- @ -капролактамгидролазы | 1983 |
|
SU1124027A1 |
Использование: в биотехнологий, а именно в микробиологической промышленности, и касается штамма-продуцента алкогольокси- дэзы с конститутивным типом синтеза этого фермента. Сущность изобретения: получен штамм Hansenula polymorpha BKI1MY1345 нечувствительный к глюкозной катаболитной репрессии и не требующий для экспрессии гена алкогольоксидазы индуктора (т.е. обладающего свойством конститутивного синтеза .фермента при росте на среде с глюкозой). Штамм продуцирует при росте на среде с глюкозой алкогольоксидазу с активностью около 0,20-0,25 мкмоль/мин на 1 мг сухой массы клеток или 1,5-1,8 мкмоль/мин на 1 кг белка в бесклеточном экстракте.
Штамм дрожжей РIснIа pINUS - продуцент алкогольоксидазы | 1989 |
|
SU1770357A1 |
кл | |||
Способ гальванического снятия позолоты с серебряных изделий без заметного изменения их формы | 1923 |
|
SU12A1 |
Сибирный А.А | |||
и др | |||
Генетика, 1986, т | |||
Машина для добывания торфа и т.п. | 1922 |
|
SU22A1 |
Очаг для массовой варки пищи, выпечки хлеба и кипячения воды | 1921 |
|
SU4A1 |
Авторы
Даты
1993-08-07—Публикация
1990-07-24—Подача