Устройство для препаративного электрофореза в полиакриламидном геле Советский патент 1990 года по МПК G01N27/26 

Изобретение относится к препара- Дивной лабораторной технике, в част- 1)ости к устройствам для электрофореза И геле, и может быть использовано для проведения препаративных работ, связанных , например, с тонкой химической или биологической технологией, с задачами экспериментальной и клинической гематологии для решения проблем,, возникающих при получении кровезаменителей.

Цель изобретения - улучшение эффективности препаративного электрофореза, повышение качества разделения И производительности фореза путем Предотвращения возникновения в геле градиентов температуры.

На Фиг.1 изображено устройство для Препаративного электрофореза; на фиг.2 - результаты двух режимов элю- ijn-ш; на фиг.З - результаты аналити- Цеского электрофореза.

Предлагемое устройство представ- собой цилиндрическую вертикаль- rtyw изготовленную из минерального Стекла электрофоретическую камеру 1, Помещенную между верхней 2 и нижней 3 электродными ваннами. Камера 1 соединена со съемной камерой 4 для сбо- ра фракций. Камера 1 снабжена витым (в виде спирали) внутренним теплообменником 5 и охлаждающей рубашкой 6, а также проходящими внутри камеры 1 трубками 7 для пропускания элюирую- щего растворителя и изогнутой трубкой 8. Камера I выполнена из двух соединяющихся друг с другом нормальным шлифом частей, причем в верхнюю (съемную) часть вмонтированы шнутрен ний теплообменник 5 и трубки 7, вводимые во внутреннее пространство нижней (стационарной) части, снабженной охлаждающе и ру б ашк ой 6.

з 0 5

0

,

0

с л

5

Устройство снабжено электромагнитным смесителем, состоящим из двух противостоящих электромагнитов 9, установленных на уровне камеры 4, пере- мешиваюшего элемента 10 в виде Ферромагнитного стержня в стеклянной оболочке s свободно расположенного в образуемом при полимеризации геля в камере 1 продольном узком приемном ка-.. нале П камеры 4, и расположенных вне устройства мультивибратора и блока электропитания (не обозначены)..

Верхняя 2 и нижняя 3 электродные ванны снабжены платиновыми электродами 12, заключенными в стеклянную оболочку с перфорациями, охлаждающими рубашками 13 и коаксиально расположенными внутренними витыми (в виде спирали) теплообменниками 14. Камера 4 снабжена полупроницаемой мембраной 15. Верхняя электродная ванна снабжена сливным штуцером 16.

Предлагемое устройство работает следующим образом.

Соединяют верхнюю и нижнюю части камеры 1 друг с другом. Нижнее отверстие камеры 4 закрывают полупроницаемой мембраной 15 (например, целлофаном), которая служит дном камеры 4. На внутреннюю поверхность дна камеры 4 укладывают шаблон из органического стекла ( 25«3,,0 мм), располагая его по диаметру закрытого мембраной нижнего отверстия камеры 4. Камеру 4 закрепляют на нижней части камеры I так, чтобы упомянутый шаблон находился в одной плоскости с обеими трубками 7. Одну из трубок 7 закрывают наглухо, а по другой через присоединенный к ее верхней части резиновый шланг на дно камеры 4 вводят 10-14 мл буферного раствора, служащего растворителем при приготовлении смеси акрил амида и N,N -метилен-бис-акрилами- да (смесь мономеров). Затем через тот

51548740

е шланг под слой введенного бусЪерно- о равтвора вводят смесь мономеров,

в р в ве сл вв ни (0 не Эл 16 бу ля зы бу не вв чт ра вы 4. ру

содержащую персульфат аммония, TEMED и сахарозу. Сначала вводят 1 0%-ную смесь мономеров, содержащую 0,1% сахарозы до нужного уровня в камере I. Затем под столб 1 0%-ной смеси мономеров вводят 30%-ную смесь мономеров, содержащую 0,2% сахарозы, чтобы эта порция ( 5 мл) слегка покрыла верхнюю поверхность помещенного в камеру 4 шаблона.

Заполнение камеры 4 и камеры 1 производят так, чтобы поверхность

раздела между вводимыми растворами сохранилась интактной вплоть до заполнения камеры 1 до нужного уровня. Заполнив камеру 1, ее оставляют в вертикальном положении вплоть до за- вершения полимеризации геля. После полимеразании его шланг, служащий для введения смеси мономеров, отсоединяют от одной из трубок 7 и закрывают

Через шланг в трубке 8 в камеру 1 вводят порпию электродного буферного раствора так, чтобы этот раствор не вытекал из трубки 8, после чего на верхнюю поверхность столба геля под слой введенного буферного раствора вводят раствор подвергаемого разделению образца, содержащий сахарозу (0,1%). Трубку 8 вместе с введенным в нее полиэтиленовым шлангом закрывают. Электродную ванну 2, закрыв штуцер 16, осторожно заполняют электродным буферным раствором. Устройство закрепляют в штативе так, что камера 4 оказывается погруженной в электродный буферный раствор, находящийся в нижней электродной ванне 3. В трубки 7 вводят полиэтиленовые шланги так, чтобы введенные концы шлангов были расположены в приемном канале 11 на высоте -х- 0,5-1 ,0 мм над дном камеры 4. Через один из этих шлангов в камеру 4 вводят электродный буферный ра

Изобретение позволяет увеличить нагрузку полиакриламидного геля (ПААГ) разделяемым веществом и повысить качество разделения за счет предотвращения возникновения в ПААГ градиентов температуры, исключения возможности механического смещения ПААГ во время электрофореза и возникновения застойных зон в приемном канале камеры для сбора фракций во время их элюирования. Для этого электрофоретическая камера 1 снабжена спиралевидным внутренним теплообменником 5 и охлаждающей рубашкой 6, проходящими внутри камеры 1 трубками 7 для пропускания элюирующего растворителя, продольным приемным каналом 11 в съемной камере 4 для сбора фракций и электромагнитным смесителем, противостоящие электромагниты 9 которого укреплены на уровне канала 11, а находящийся в этом канале перемешивающий элемент 10 совершает челночные передвижения по всей длине канала 11. 1 з.п. ф-лы, 3 ил.

ее. Верхний слой из буферного раство- 25 створ, заполняя им приемный канал II ра удаляют из камеры 1. Камеру 4 снимают, отделяют от камеры 1, прочищают ее и, сполоснув дистиллированной водой, отставляют при комнатной температуре. Трубки 7 тщательно прочи- 30 щают, восстанавливая полностью их проходимость на всей протяженности. Из открытой лосле снятия камеры 4 поверхности нижнего конца столбца геля удаляют шаблон.

35

камеры 4. Включают систему протока хладагента через охлаждающие рубашки и в утренние теплообменники, блок электропитания (не обозначен) платиновых электродов 12 и источник электропитания (не обозначен) электромаг- тов 9.

Контролировать ход электроФорети- ческого разделения можно путем анализа фракций непрерывной или прерывистой элюции содержимого приемного канала 11 камеры 4, направляя порпии элюата на какой-либо регистрирующий прибор и/или на коллектор Фракций. Таким же путем и в таком же режиме можно извлекать из приемного канала 11 камеры 4 поступающие в него индивидуальные Фракции. Извлекать последние можно, кроме того, снимая камеру

Остающуюся в геле после извлечения шаблона канавку обрабатывают скальпелем, углубляясь на йН ,0-1,5 мм. В канавку вкладывают ферромагнитный стержень 10 в стеклянной оболочке. Заполняют канавку элюирующим растворителем. Выходные отверстия нижней части трубок 7 должны быть свободными и должны сообщать трубки 7 с полостью канавки без каких-либо препятствий. Камеру 4 вновь соединяют с нижней частью камеры 1. При этом канавка в геле превращается в продольный узкий приемный канал 11 со свободно расположенным в нем перемешивающим элементом 10. Подключают противостоящие на уровне дна камеры 4 электромагниты 9 и проверяют подвижность перемешивающего элемента 10 в канале 11: элемент 10 должен при этом совершать челночные передвижения по всей длине канала 11.Верхнюю электродную ванну 2 соединяют с камерой 1.

5 створ, заполняя им приемный канал II 0

5

0

5

0

5

камеры 4. Включают систему протока хладагента через охлаждающие рубашки и в утренние теплообменники, блок электропитания (не обозначен) платиновых электродов 12 и источник электропитания (не обозначен) электромаг- тов 9.

Контролировать ход электроФорети- ческого разделения можно путем анализа фракций непрерывной или прерывистой элюции содержимого приемного канала 11 камеры 4, направляя порпии элюата на какой-либо регистрирующий прибор и/или на коллектор Фракций. Таким же путем и в таком же режиме можно извлекать из приемного канала 11 камеры 4 поступающие в него индивидуальные Фракции. Извлекать последние можно, кроме того, снимая камеру

4 и заменяя ее аналогичной камерой.

i i

По завершении электрофореза систему протока хладагента через охлаждающие рубашки и внутренние теплообменники перекрывают. Составляющие эту систему шланги отсоединяют. Источники электропитания отключают. Удаляют-нижнюю электродную ванну 3. Отделяют верхнюю электродную ванну 2 от элект- рофоретической камеры 1. Из трубок 7 и 8 извлекают полиэтиленовые шланги. Отсоединяют камеру для сбора Фракций 4 от электрофоретической камеры 1 . Освобождают камеру 4 от полупронипаемой мембраны 15 и перемещающего элемента 10. Заполнявший камеру 1 гель разрушают и удаляют. Все детали разобранного устройства хорошо поддают- ся очистке, мойке и сушке.

Приме р. Наделение мономерного сывороточного альбумина из препаратов сывороточного альбумина человека и крупного рогатого скота.

Препарат сывороточного альбумина человека окрашивали известным способом проиионовым ярко-синим RS. Навес- у (80 мг) лиофипизированного окра- |пенного белка растворили в 1 мл элек- тродного трисглииинового буферного |раствора (рН 8,8). Раствор белка, содержащий добавленную сахарозу (0,1%) И добавленньй свободный пропионовый 1 раситель (0,3 мг) , ввели в электро- форетическую камеру 1 (фиг.1) диаметром 3,4 см и высотой 4,5 см, заполненную 10%-ньм ПААГ (рН 8,3). Нагруз- ча геля белком 9 мг/см , ЭлектроАо- эез проводили при напряжении 500 В в Уечение 18 ч (сила тока 12-18 мА) . В ходе электрофореза происходит еткое разделение в геле фракций сво- одного мономерного и ассоциированно-4 о свободного красителя8 мономерного, .имерного и прочих олигомерных форм .-ртьбумина без каких-либо деформаций Перечисленных фракций и без каких- jjra6o локальных нарушений их миграции и геле, которые обычно возникают из- ;ia неравномерности охлаждения геля и формирования в нем градиентов температур;,. Электрофорез при использова- ии предлагаемого устройства можно г|рерьшать на 8-10 ч, отключая устрой- Ство от источника электрэпитания. К моменту возобновления электрофореза с|ам столб геля в электрофоретической йамере и разделенные в нем Фракции Сохраняли свое положение практически без изменений.

Извлечение Фракций из камеры для сбора фракций 4 (фиг.1) производили в режиме непрерывной элюши с включенной или выключенной электромагнит- ной мешалкой, начиная элкшию через 10 ч после начала фореза. Результаты, полученные при указанных двух режимах злкшии, представлены на Лиг. 2.

На фиг.2 видно, что элюиия бракуй из камеры для их сбора при выключенной электромагнитной мешалке не Дает четкого разделения элюируемых фракций за счет возникновения в прием

0 5 0 с 0 5

/

5

ном канале II камеры 4 (фиг.1) застойных зон и сорбции Фракций на внутренних стенках канала. Включение электромагнитной мешалки и связанное с зтщ интенсивное постоянное перемешивание содержимого приемного канала 11 резко и значительно повыпает качество разделения элюируемых Фракций и несколько повышает их количественный выход за счет устранения застойных зон в канале и сорбпии белков на его стенках.

Извлеченную из приемного канала 1 1 камеры 4 для сбора гНракиий (Фиг.1) Фракцию мономерного альбумина подвергали аналитическому электрофорезу в ПААГ в микроэлектроЛоретической камере с последующей окраской геля ку- масси-синим G-250.

Результаты аналитического электрофореза представлены на Фиг.З. Из фиг.З видно, что с помощью предлагаемого устройства для препаративного электрофореза в ПААГ удалось получить фракцию мономерного альбумина, полностью освобожденную от димерной и прочих олигомерных форм белка (дорожки 17-20), находящихся в исходном ин- тактном белковом препарате (дорожки 21 -23). Выход мономерного белка составлял 68 мг.

Аналогичные результаты получили также при использовании предлагаемого устройства для электрофореза неокрашенного сывороточного альбумина челока, окрашенного пориионовым ярко- синим RS сывороточного альбумина и неокрашенного сывороточного альбумина крупного рогатого скота, i Формула и З Ю б Ф е т е н и я

пропускания элпирукмчего растворителя, внутренние теплообменники выполнены в виде спирали.

Ю П 1Z

13 М 15 16 77 76

Время элюцци(час)

Фиг. г

теплообменника электроЛоретической камеры составляет 0,71-0,73, диаметр теплообменника 0,13-0,15 ее диаметра, а расстояние между его витками составляет 0,14-0,16 высоты находящегося в ней столба геля.

- А

- gi.JE rr -sgabj jaJpr-.

/7 « /9 Я ;/ ff /j

0K2.J